非酒精性脂肪性肝病的血清蛋白质指纹图谱的临床研究.docVIP

　　非酒精性脂肪性肝病的血清蛋白质指纹图谱的临床研究 【摘要】 分析非酒精性脂肪性肝病患者血清蛋白质指纹图谱，探讨非酒精性脂肪性肝病患者蛋白表达的差异性。［方法］应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDITOFMS）及弱阳离子交换蛋白质芯片（a公司。（2）方法：①血清标本处理：在29例NAFLD患者和16例正常健康人中各空腹采集静脉血3ml，采集后立即于4℃低温冰箱静置2h，4℃，4000r/min离心10min分离血清，将血清于4℃，12000r/min再次离心5min，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为每管100μl，保存于-80℃冰箱。实验检测血清均仅一次冻融。从-80℃冰箱中取出血清样品，于4℃，10000 r/min，离心5min；取血清10μl，加入20μlU9缓冲液（9M Urea，2%CHAPS，50mM TrisHCl，pH9.0）稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min，400r/min；将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结合缓冲液混匀，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。② NaAc，Ph4.0）加至已装好S1 Minishaker）400～600r/min震荡5min，甩掉缓冲液。重复上述操作2次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的标本，置振荡器400～600r/min，4℃震荡1h；甩出标本。每孔加入200μl结合缓冲液，室温置振荡器400～600r/min，震荡5min，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔上加SPA0.5μl，干燥后再重复加SPA0.5μl一次，然后用蛋白质指纹图谱仪（SELDITOFMS，美国Ciphergen公司）阅读芯片。③蛋白质指纹图谱的测定参数和标化：在读取数据前，用加有allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子误差lt;0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定：最佳激光强度240，最佳检测灵敏度8；设最高检测分子质量为50Da，最佳状态从1Da到15000Da；蛋白质指纹图谱的标化参数：蛋白峰范围质荷比（m/z）2000～45000；m/z为6634.8的蛋白为所有蛋白谱的共有蛋白，作为校正的内参照。 郎笑梅，等: 非酒精性脂肪性肝病的血清蛋白质指纹图谱的临床研究 　　 3 统计学处理 蛋白质指纹图谱统计用Ciphergen ProtEin Chip软件，数据输入 计算 机，两样本总体方差齐同时，两样本均数用t检验；两样本总体方差不齐同时，两样本均数用近似t检验。 　　 4 结果 29例NAFLD患者与16例正常对照组血清蛋白质指纹图谱建立后，在（m/z）2000～45000Da范围内，共检测出14种有差异蛋白（Plt;0.05），m/z为3401、4477、7976、8943、13749、15929、16098和23385的8种血清多肽蛋白在NAFLD患者中的浓度显著增高，而m/z为2190、2958、3163、5911、6116和33331的6种血清多肽蛋白在NAFLD患者中的浓度显著降低。特别是2958、3163、5911和6116的4种多肽蛋白浓度较正常对照组降低一倍多；而4477、7976和8943的3种多肽蛋白浓度较正常对照组极显著增高。差异极显著的多肽蛋白质结果见表1。表1 非酒精性脂肪性肝病的差异蛋白与正常组比较（略）差异极显著的多肽蛋白质指纹图谱见图1。 　 　5 讨论 本文应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术，随机选择29例NAFLD患者和16例正常健康人为对照组进行血清蛋白质指纹图谱检测，两组间共检测出14种有差异蛋白（Plt;0.05），说明NAFLD患者与正常健康人血清蛋白质指纹图谱存在差异，NAFLD患者中8种血清多肽蛋白浓度显著增高，6种血清多肽蛋白浓度显著降低。特别是m/z为2958、3163、5911和6116的4种血清多肽蛋白浓度。有报道［23］8943的蛋白在肝硬化和肝癌中高表达，且在肝癌中浓度明显高于肝硬化患者；而4477的蛋白仅在肝癌患者中高表达。在NAFLD患者中4477和8943的多肽蛋白浓度增高，势必提示在NAFLD患者中早已潜伏着向肝硬化和肝癌转化的病理基础，此点有进一步论证的意义。另一方面，m/z为5911血清多肽蛋白浓度显著下降，也可能提示此多肽蛋白为NAFLD标志性蛋白，在NAFLD的发病机制中起主要作用。国外已建立血清蛋白质指纹图谱数据库［4］，可根据质荷比查找对应的蛋白质，从而为分析疾病发病机制提供依据。本研究下一步将选取差异显著的14个质荷比点进行数据库搜索，查找对应的蛋白质，分析非酒精性脂肪性肝病发病机制。 【 参考