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PCR技术上岗培训 疾病的诊断 分子诊断 影象学 诊断 细胞/组 织诊断 临 床 诊 断 免疫诊断 生化诊断 几乎所有的疾病都是基因病 科学研究已证明，基因可以揭示疾病的本质，人类几乎所有疾病都直接或间接与基因有关，在某种意义上都是基因病， PCR技术 1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说,仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性，可用于微量核酸样品的检测。 PCR技术 PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体（现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入疾病诊断的常规技术。 1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 标准的PCR过程分为三步 荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了方便之门，现已得到广泛应用。 荧光PCR检测技术简介 短柄圆环探针荧光PCR原理 分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。 荧光标记 荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报告基团 探针荧光标记及 荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5标记探针 淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL） 影响分子信标的主要因素 分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。 另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结