湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查.docVIP

　　湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查 湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查 　摘要：对２００６～２００９年湖北省规模化养鸭主要疫病的流行情况进行实地调查和实验室诊断。共调查７个地（市）７９个养鸭户和养鸭场１８２ ８５０只鸭的主要疾病流行情况。成年鸭主要疾病有禽流感、鸭瘟、副粘病毒病、巴氏杆菌病、大肠杆菌和沙门氏菌混合感染等，调查３６群成年鸭共８３ ２００只，其中发病２６ ８９０只，发病率３２．３％；死亡６ ７３７只，病死率２５．１％；对产蛋鸭生产性能均有不同程度影响。雏鸭的主要疾病有鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病和沙门氏菌病等，调查４３群雏鸭共９９ ６５０只，其中发病１９ ７２０只，发病率１９．８％；死亡５ ５４１只，病死率２８．１％。从采集的病料中分别分离到７株禽流感病毒、３株副粘病毒和３株鸭肝炎病毒；分离到１７株鸭疫里默氏杆菌、３６株大肠杆菌、９株巴氏杆菌等病原菌。 　　关键词：鸭；流行病学调查；病原分离鉴定；湖北省 　　中图分类号：Ｓ８５８．３２ 　　１．２．２ 用于检测鸭瘟病毒病料的ＤＮＡ提取 将病料进行充分研磨（病料1 g加4 mL ＰＢＳ），反复冻融３次，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清液５００ mu;Ｌ，加入蛋白酶Ｋ至终浓度为５００ mu;ｇ／ｍＬ，ＳＤＳ至终浓度为１％，充分混匀后，置５５ ℃水浴作用３０ ｍｉｎ。然后用Ｔｉｒｓ饱和酚抽提１次，吸取水相，加１／１０体积３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ及２．５倍体积无水乙醇沉淀，离心弃上清。沉淀用７５％乙醇洗涤，自然凉干后溶解于一定量的灭菌去离子水中，作为ＰＣＲ扩增模板。 　　１．２．３ 鸭瘟病毒ＰＣＲ反应体系 组成为：１０ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ ５ mu;Ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ mu;Ｌ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３ mu;Ｌ，ＰＣＲ上、下游引物各１ mu;Ｌ，模板ＤＮＡ ２ mu;Ｌ，ｒＴａｑ酶（５ Ｕ／mu;Ｌ）０．５ mu;Ｌ，加灭菌超纯水至５０ mu;Ｌ。反应条件为：９５ ℃预变性１０ ｍｉｎ；按９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５４ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１．５ ｍｉｎ，共进行３３个循环；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用２％琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察其扩增片段大小。以出现特异且大小相符条带的样品为阳性。 　　１．２．４ 用于检测禽流感病毒、禽副粘病毒、鸭病毒性肝炎病毒病料的ＲＮＡ提取 取步骤１．２．２ 制备的２００ mu;Ｌ组织病料悬浮液上清，加入８００ mu;Ｌ Ｔｒｉｚｏｌ ＲＮＡ裂解液混匀，室温放置１０ ｍｉｎ；加入２００ mu;Ｌ 氯仿，混匀，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，吸取水相，加入等体积的异丙醇，冰浴放置１０ ｍｉｎ 后，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ；沉淀用７５％乙醇洗涤，在超净台中通风晾干；ＲＮＡ 沉淀溶解于２０ mu;Ｌ 用ＤＥＰＣ 处理过的灭菌去离子水中，作为ＲＴ－ＰＣＲ检测模板。 　　１．２．５ ＲＴ－ＰＣＲ检测 禽流感、副粘病毒、鸭病毒性肝炎病毒的扩增条件基本一致。ＲＴ反应总体积为２５ mu;Ｌ，组成如下：５ＲＴ Bｕｆｆｅｒ ５ mu;Ｌ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ） ２ mu;Ｌ， ＭｇＣｌ２ （２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１ mu;Ｌ， ＲＮａｓｉｎ（４０ Ｕ／mu;Ｌ）１ mu;Ｌ，ＲＴ引物１ mu;Ｌ，ＲＮＡ 模板１３ mu;Ｌ，混匀离心。６５ ℃作用１５ ｍｉｎ，待稍微冷却后，加入Ｍ－ＭＬＶ（２００ Ｕ／mu;Ｌ）１ mu;Ｌ，４２ ℃ １ ｈ；９５ ℃作用５ ｍｉｎ，冷却后即可进行ＰＣＲ。 　　ＰＣＲ反应总体积为５０ mu;Ｌ，包括：１０ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ 5 mu;Ｌ，ＭｇＣｌ２ （２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１．４ mu;Ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ mu;Ｌ，两条ＰＣＲ引物各１ mu;Ｌ，ＲＴ 产物２ mu;Ｌ，ｒＴａｑ 酶（５ Ｕ／mu;Ｌ）０．５ mu;Ｌ，加去离子水至５０ mu;Ｌ，混合均匀。将混合物９５ ℃变性５ ｍｉｎ 后进入ＰＣＲ 循环。参数设置为９４ ℃ １ ｍｉｎ，５１ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ。30个循环。待ＰＣＲ结束，取ＰＣＲ 产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小。以ＰＣＲ 产物中出现目的条带的样品为阳性。 　　１．２．６ 病毒分离鉴定 经ＰＣＲ测定禽流感病毒（ＡＩＶ）为阳性的病料，用含双抗的Ｈａｎｋｓ液洗涤３次，磨碎（1 g病料加8 mL Ｈａｎｋｓ液）乳剂，然后反复冻融３次，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，取上清液杂检无菌后保存于－１０ ℃备用，按殷震等［８］介绍的方法，分别接种ＳＰＦ鸡胚、鸭胚或细胞，对分离物按照鸭瘟病毒、禽流感