糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义.docVIP

　　糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义 【摘要】 目的： 建立糖尿病大鼠模型，探讨糖尿病大鼠尿中nephrin 的检测、动态变化及意义。 方法 ： SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液，动态检测各组大鼠24 h尿微量白蛋白及肾功能，以ethods： SD rats odel al control group icroalbumin and renal function bulatorily monitored, and Urinary Nephrin easured al control group, but it urine at the early stage of diabetic nephropathy. Urinary nephrin could not only be regarded as a specific index for the early diagnosis of diabetic nephropathy, but also be benificial to clinical monitoring and evaluating the degrees of the DN. 　　［Key icroalbumin; urinary nephrin 　　糖尿病肾病(diabetes nephropathy，DN)是糖尿病微血管病变之一，是终末期肾衰的重要原因，早期诊断和 治疗 可延缓其 发展 。DN起病隐匿，早期诊断困难， 目前 公认的诊断早期DN的指标是尿微量白蛋白，但也仅使DN诊断提早到依据Mogensen建议的Ⅲ 期。部分糖尿病患者当发现微量白蛋白尿时，肾脏的结构损害已很明显［1］。因此不能单以尿微量白蛋白的出现来判断早期DN。 　　蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关，nephrin是新近发现由足细胞表达、特异定位于肾小球足细胞裂孔隔膜的蛋白分子，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能［2］。 研究 表明，实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有nephrin表达的改变，且nephrin可从尿中排泄［3］。而尿中nephrin排泄量增加是否可敏感反映糖尿病早期肾脏损害，目前国内尚未有报道。本文对糖尿病大鼠尿蛋白排泄率(AER)及尿液nephrin进行动态观察，旨在探讨尿nephrin在DN中的变化 规律 及其对早期DN的诊断意义。 　　1 对象与方法 　　1.1 实验动物及分组 　　雄性SD大鼠76只，体质量230～280 g，购自江苏大学医学院实验动物中心，血糖正常。试验期间，室温控制在18～20℃，湿度48%，12小时交替照明，大鼠自由饮水进食，保持垫料干燥。实验共分对照组（n=36），糖尿病组（n=40）。对照组0周处死6只，再与糖尿病组随机分为2，4，6，8和12周5个亚组，分别于DM诱模后2，4，6，8和12周处死。 　　1.2 糖尿病模型的建立 　　所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只，禁食12 h后，空腹状态下，链脲佐菌素（STZ）按55 mg/kg一次性腹腔注射制备糖尿病模型，STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1 mmol/L, pH4.2)配制。24 h后大鼠血糖开始升高，72 h后剪尾采血测血糖，持续高于16.7 mmol/L为DM模型建立成功［4,5］。DM模型建成后，每周测血糖一次，不符合标准者弃去。共有36只造模成功，其中有3只死亡。正常对照组仅注射等量枸橼酸钠缓冲液(0.1 mmol/L)。全部大鼠自由饮食。 　　1.3 标本留取 　　实验初，处死6只大鼠作为正常对照，并分别于注射STZ后2，4，6，8，12周末，对照组、糖尿病组随机取大鼠各6只，分别放入代谢笼中收集24 h尿液，计尿液总量后离心(2 000 r/min,10 min)，取上清液10 ml，-20 ℃冰箱保存待测。予0.3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉下，剪尾采血测血糖，腹部正中切口，心脏采血5 ml，分离血清，用于生化指标测定。 　　1.4 指标观察和测定方法 　　1.4.1 生化指标检测 采用免疫比浊法测定24 h 尿微量白蛋白；采用全自动生化 分析 仪检测血尿素氮（BUN）、血肌酐、尿肌酐，按公式Ccr=［尿肌酐浓度（μmol/L）×每分钟尿量（ml/min）］/［血浆肌酐浓度（μmol/L）·体质量（kg）］ 计算 血清肌酐清除率。 　　1.4.2 蛋白质印迹杂交 取大鼠24 h尿液离心后的上清液。每1 ml尿液样品置透析袋中用聚乙二醇8000高渗浓缩至100 μl标本。组内大鼠各取等体积离心浓缩尿液混合，将各组大鼠等体积尿混合液经12%SDS电泳后，转移至硝酸纤维膜上，用封闭蛋白干粉封闭后，分别加入一抗（兔抗鼠n