糖尿病模型大鼠骨骼肌VEGF、bFGF、NGF的表达及意义.docVIP

　　糖尿病模型大鼠骨骼肌VEGF、bFGF、NGF的表达及意义 作者：成秀梅 王晓松 戎士玲 张永健 【摘要】 目的 探讨骨骼肌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)与糖尿病肌病发生的关系。方法 选用 SD 大鼠，随机分成对照组和模型组。以链脲佐菌素 50 mg/kg 腹腔注射制造糖尿病模型。8 a公司，枸橼酸缓冲液为0.1 mmol/L，pH4.2～4.5），按50 mg/kg腹腔内一次注射;72 h后，取尾尖血测定血糖值。凡血糖＞16.7 mmol/L者纳入实验，本实验有12只造模成功。对照组10只大鼠仅腹腔注射等体积的枸橼酸钠缓冲液。 　　1.2 标本收集及检测方法 　　8 ×0.5 cm×0.5 cm）于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片， HE染色，观察骨骼肌组织形态变化；采用免疫组化染色，观察骨骼肌VEGF、bFGF、NGF 表达（VEGF、bFGF试剂盒购于Santa Cruz公司，NGF试剂盒购于北京博奥生物技术有限公司）。细胞质内见染成棕黄色颗粒的骨骼肌细胞，认定为表达阳性细胞。用Nikon显微照相系统对骨骼肌组织切片进行观察、照相。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统，在400倍视野下每张切片取5个视野，测定平均灰度值作半定量分析，用以反映其蛋白表达水平。 　　1.3 统计学处理 　　采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，所有数据均用x±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。 　 　2 结果 　　2.1 一般情况 　　造模前各组大鼠反应灵敏，毛发光滑，毛色正常，饮食正常，行动敏捷。STZ注射造模3 d后，大鼠开始出现多尿、多饮、多食症状，并逐渐出现消瘦、精神萎靡、体毛枯黄、稀疏、大便不成形、体形明显消瘦、行动迟缓、反应迟钝等症状，整体状态差。 　　2.2 血糖测定比较 　　实验结束时，对照组大鼠和模型组大鼠的血糖分别为（6.75±0.58）、（31.32±2.16）mmol/L，模型组血糖明显高于对照组（Plt;0.01）。说明糖尿病模型复制成功。 　　2.3 病理形态学改变 　　对照组大鼠骨骼肌表现为正常的组织学结构，肌膜完整、清晰，肌纤维上明暗条纹规则整齐。模型组大鼠骨骼肌表现为普遍性萎缩，纤维变性、水肿，部分区域坏死，纤维断裂，肌丝走行紊乱，核固缩，横纹模糊消失。 　　2.4 骨骼肌VEGF、bFGF及NGF蛋白表达 　　对照组大鼠骨骼肌可见VEGF﹑bFGF、NGF表达，阳性细胞呈棕黄色。模型组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF的蛋白表达平均灰度明显高于对照组（Plt;0.01），表明模型组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF蛋白表达水平低于对照组。见表1和图1。表1 各组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF，表达的平均灰度(略)。 　　3 讨论 　　骨骼肌由具有独特的代谢和循环特征的不同纤维类型所组成，糖尿病状态下均普遍受损，组织形态学改变主要表现为肌纤维萎缩和退化、灶性肌丝降解和线粒体异常。引起糖尿病肌病的因素包括糖尿病血管病变（以微血管病变为主）、代谢紊乱（多元醇通路和己醣胺通路的激活、氧化应激和糖基化终末产物的形成）、糖尿病神经病变。骨骼肌病变将使骨骼肌对胰岛素刺激的葡萄糖摄取敏感性下降，葡萄糖摄取减少，周围胰岛素抵抗恶化，糖尿病的代谢紊乱进一步加重。特别是高血糖对骨骼肌及其相应血管神经损害，引起其结构和功能改变。 　　VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性有丝分裂因子和血管生成因子，能特异地直接作用于血管内皮细胞，其作用涉及促进内皮细胞增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质、血管生成和维持功能等生物学行为，在微血管结构和功能改变的病理生理过程中发挥重要作用〔2〕。糖尿病骨骼肌中闭塞血管周围侧支血管形成明显减少，而在动脉阻塞病理进展及侧支血管网逐步建立过程中，VEGF起着极其重要作用。缺血骨骼肌VEGF蛋白水平的提高可以通过旁分泌作用促进内皮细胞的增殖、移行，以形成新的毛细血管 网络 〔3〕。本实验通过免疫组化对骨骼肌内VEGF蛋白变化进行研究发现，模型组大鼠骨骼肌中VEGF表达明显低于对照组，糖尿病大鼠骨骼肌VEGF的低水平导致组织新生血管下降。因此，VEGF水平下降可能也是糖尿病骨骼肌萎缩的重要原因，适当增强VEGF表达可能是 治疗 糖尿病骨骼肌病变的有效方法。 　　bFGF是一种具有广泛生物活性的肽类物质，对肌卫星细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等中胚层来源的细胞有明显的促增殖作用，在骨骼肌损伤后的修复中起重要作用。本实验应用免疫组化方法检测大鼠骨骼肌中bFGF蛋白表达的变化。结果显示，模型组骨骼肌bFGF表达明显低于正常组，提示糖尿病骨骼