2-核酸分子杂交汇.pptVIP

实验目的 掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理及方法并能熟练操作 对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总RNA 重点掌握Northern杂交基本原理、基本实验步骤和检测方法 利用Northern杂交检测目的基因的时空表达情况，如不同生长发育阶段、不同的组织部位、不同生长环境等条件下相关基因的表达情况 植物总RNA 的提取及电泳检测 实验原理 细胞破碎，核酸溶出 液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。 细胞提取液可溶出核酸。 核酸的纯化 DNA的去除 酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。 多糖、次生代谢物 核酸的保护（内源RNA酶） 低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。 实验设备 常规设备 移液器，tip头，离心机 RNA电泳 金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统 紫外分光光度计 实验试剂 RNA提取液 100 mmol/L Tris–Cl pH8.5 20 mmol/L EDTA pH8.5 0.2M NaCl 1%SDS β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇 琼脂糖、MOPS、EB替代品 实验步骤 向1.5 mL 离心管中加入700?L RNA提取液，35μL的β-巯基乙醇（终浓度5%）。 取适量材料，在液氮充分研磨成粉末后，装入离心管中，用力充分混匀。 加入苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）各350μL，混匀10min，4℃ 8000rpm离心10min。 取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡10min，4℃ 8000rpm离心10min。 取上清，加入等体积的异丙醇和1/10体积的5 mol/L NaCl，充分混匀。-20℃放置20min后4℃，12000 rpm离心10 min。 弃上清，70%乙醇洗沉淀，离心，4℃12000 rpm离心5 min。 弃上清，通风橱内干燥沉淀。 沉淀溶于20 μL灭菌水中，备用。 五、实验步骤 RNA浓度测定 取1ul RNA样品，加水199ul后读取260nm处的吸光度值 260nm处的吸光度值相当于40μg/ml单链RNA，以此来计算样品含量。 260nm和280nm读数比值（A260/A280）可反映核酸的纯度 纯品的A260/A280的值为2.0， 低于A260/A280，有蛋白质或酚的污染。 实验步骤 RNA电泳 RNA变性处理 1ul RNA样品加入2.5ul 上样缓冲液，混匀后65℃温育5-10min置于冰上冷却（20ul RNA+50ul上样缓冲液） 检测RNA的凝胶要配制 MOPS 甲醛 电泳缓冲液为1×M0PS 实验步骤 注意事项 特别要注意的是在所有器具严格消毒，实验过程中需要带手套，减少说话和走动等防止RNase的污染，来保证RNA不被降解。 分子杂交 核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。 属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过Watson—Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。 杂交的双方是待测核酸及探针（probe） 待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组DNA或总RNA 被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。 分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。 要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。 同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。 Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。 将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的离子强度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA-DNA杂交双链。 利用探针中的digoxigenin和anti-digoxigenin-Ap抗体结合，再通过碱性磷酸酶AP与CDP-star底物作用，检测CDP-star的化学发光间接进行定量分析。 若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。 实验原理－RNA提取 细胞破碎，核酸溶出 液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。 细胞提取液可溶出核酸。 核酸的纯化 DNA的去除 酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。 多糖、次生代谢物 核酸的保护（内源RNA酶） 低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RN