石蜡包埋组织的DNA提取和影响因素.pptVIP

福尔马林固定石蜡包埋组织DNA的提取及影响因素 2012.12 娄全博 现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类的疾病研究，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展等方面均具有重要意义。 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。 Goelz(1985)成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。 石蜡包埋组织DNA提取的流程图 组织包埋制作过程中的影响因素 1.1福尔马林固定 福尔马林固定液的主要成分：甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以和带有-OH（羟基）、-SH（巯基）、-NH2（氨基）的分子发生亲核加成反应，最终作为亚甲基(-CH2-)的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被交联起来，从而发挥对组织固定的作用，同时也对DNA分子产生不利的影响。最早表现为DNA分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随固定时间延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，导致DNA链的脆性增加，在受到剪切力作用时，更容易发生随机断裂[1]。 甲醛介导的DNA损伤，在固定3h后已发生。固定时间越长，甲醛所致DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA。相关文献记载固定时间分别为3、7、16、32d且保存15年的包埋组织进行研究的结果显示，固定16d可成功获取250bp左右的DNA片段，固定32d则仅能获取100bp左右DNA片段[2] 。甲醛除本身可造成DNA分子损伤外，其与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境pH，从而影响DNA分子稳定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷键容易发生水解而导致DNA链断裂[3]。实验证明，中性缓冲型福尔马林固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使环境pH得以稳定，在所提取DNA的质和量上都明显优于其他固定剂。 1.2 浸蜡与包埋 用于组织包埋的固体石蜡为多种烃烷混合物，溶程为50℃～65℃，其化学性质稳定，在通常条件下不与酸性（除硝酸外）和碱性溶液发生作用。迄今尚无石蜡能直接导致包埋组织中DNA降解的报道。但有文献记载，在石蜡包埋过程中DNA更容易发生降解。其可能的机制是组织浸蜡与包埋时需要加热到62℃左右，此时DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而导致的降解[4] 。另外，石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。在DNA提取过程中，如未能有效去除石蜡，形成的DNA-石蜡混合液，不利于PCR 扩增[5]。 1.3 切片规格 为保证包埋组织中提取的DNA量能够满足后续检验的需求，可通过增加切片厚度或增加切片的张数来实现。但切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化，而切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多[6]。文献中对比观察切片厚度为2.5μm、5.0μm 和10.0μm三种情况下进行二甲苯脱蜡后，有机溶剂法提取DNA的质量差异。三者比较，10.0μm切片DNA质量最好，2.5μm切片提取的DNA在PCR扩增后电泳，虽可见目的基因条带，但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱基序列，效果远不如其他两种情况[7]。 DNA提取的预处理—脱蜡 为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子的和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底地脱蜡，这是与其他生物性检材提取DNA过程的最大不同点。 2.1 有机溶剂脱蜡法 二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂。首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于室温下脱蜡，一般进行两次，分别为2h和12h。然后用梯度乙醇(100%至70%)复水，使组织结构疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕量的二甲苯和甲醛。待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消化缓冲液。根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的温度(48℃或65℃)、增加脱蜡的次数、延长脱蜡或复水时间等。该法脱蜡比较彻底，利于组织消化，但是过多的操作步骤增加了DNA受污染的可能，亦容易人为地造成DNA机械性损伤，并且需要接触有毒物质二甲苯。 2.2加热脱蜡法 通过加热