黄磷、亚砷酸钠亚急性肝损害大鼠肝脏酶组织化学定量研究：(Ⅰ)线粒体标志酶的变化.docVIP

　　黄磷、亚砷酸钠亚急性肝损害大鼠肝脏酶组织化学定量研究：(Ⅰ)线粒体标志酶的变化 关键词：黄磷；亚砷酸钠；毒性；肝疾病；组织细胞化学；酶学；疾病模型，动物；大鼠 　　在中毒性肝损害中线粒体作为毒物作用的“靶细胞器”，对各种毒物非常敏感，其生化功能首先受到干扰，最后导致其结构破坏［1，2］。镁ATP酶(Mg2+-ATPase)，单胺氧化酶(MAO)，琥珀酸脱氢酶(SDH)，细胞色素氧化酶(CO)作为线粒体内外膜标志酶，经组织化学(组化) 方法 原位显示酶的活性，并定量观察中毒性肝损害时酶活性的动态变化对评价毒物的毒理作用及各种毒物不同的作用特点具有重要意义。本 研究 通过对黄磷，亚砷酸钠中毒大鼠肝脏上述酶的组化染色，利用图像 分析 技术对肝小叶各区带酶活性定量测定，并结合光镜及电镜下毒物结构损害的特点［3］，探讨黄磷和砷肝损害的酶学特点及其中毒机制。 1　材料与方法 1.1　试剂与仪器　ATP二钠盐(中科院上海生化研究所)；丁二酸钠(上海试剂一厂)；细胞色素C(Sigma公司)；盐酸色氨(Serva公司)；氯化硝基四氮唑蓝(上海前进试剂厂)；二氨基联苯胺(Sigma公司)；Histostat低温冷冻切片机(美国)；图像分析仪(德国)。 1.2　动物分组与染毒方式　健康雄性大鼠90只，体重(267±32) g，常规饲养，随机分为三组，每组30只。黄磷(P组)1.5 mg/kg溶于芝麻油，亚砷酸钠(As组)20 mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，剂量为每100 g体重0.2 ml，每周三次，连续12周。对照组给予等体积的芝麻油。 1.3　酶组化及图像分析方法　染毒后每2周各组随机抽取大鼠5只，放血处死。取出肝脏立即在右肝正中切取5 mm×5 mm×3 mm组织块，“AO”低温冷冻切片机在-15 ℃下切成10 μm厚切片。继而入新配制的孵育液作孵育等系列处理，甘油明胶封片。同时作去底物空白对照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO组化均采用经典方法［4］，并经本研究室改良。标本次晨作图像分析处理。在荧光屏直视下划出肝小叶及其区带。该图像分析以光密度(OD)值表示染色的深线，光密度值大表示酶活性高。中央静脉区参数为OD1，中间带为OD2，周围带为OD3，全小叶为ODt。各组选取第2，4，10，12周标本5只，每一标本随机取5个视野。所得参数由 计算 机作统计处理 ，多样本均数的两两比较用方差分析，方差不齐者用秩和检验。 2　结果 2.1　Mg2+-ATPase的变化　该酶活性主要位于肝小叶周围带，反应颗粒呈棕褐色点状和线状(封四图1)。砷染毒早期(2～4周)，OD1酶活性增高(封四图2)；黄磷组则各区带酶活性下降(封四图3)，其后(10～12周)两组酶活性均下降。详见附表。 与对照组同期比较：1)P＜0.05；P＜0.01 2.2　SDH的变化　对照组反应为紫蓝色甲颗粒，主要定位于肝小叶OD3，OD1相对较低，P，As染毒后，酶活性普遍下降(各时间组ODt与对照组比较，P＜0.05)，但OD1酶活性均无明显 影响 (P＞0.05)。 2.3　MAO的变化　反应物为紫色，对照组主要分布在周围带。P，As染毒后ODt和OD3下降明显，但As组12周较10周酶活性增高(41.27±5.976 vs 35.17±9.254，P＜0.05)。 2.4　CO的变化　反应物为棕色颗粒，对照组主要位于肝小叶周围带，从中央带到周围带酶活性梯度递增。在染毒早期(2～4周)各区带酶活性无明显变化。P组10～12周OD3活性下降(P＜0.05～0.01)，As组12周OD1酶活性增高(40.42±8.607 vs 32.48±8.896)，P＜0.01)，其它区带变化不明显。 3　讨论 3.1　肝小叶中酶活性的正常分布及意义　经典肝小叶作为一古老概念，由于光镜下边界清楚，现仍用于教学和科研中。“肝腺泡”的引入无疑对肝功能的结构基础解释更为完善，对肝脏病理和毒理 研究 有重大意义［5］。将肝小叶分为三个区带，基本上与肝腺泡结构吻合。小叶中央带相当于6个单腺泡的第Ⅲ带；周围带相当于6个单腺泡的第Ⅰ带，只是门管区周围包括了腺泡3个带的部分肝细胞。肝小叶周围带集中大量的线粒体，其标志酶含量极丰富，是生物氧化过程的主要场所；也最先接触毒物。而中央带富含混合功能氧化酶［6］，是药物(毒物)代谢的场所，肝细胞营养条件差，最受到药物(毒物)的损害。 3.2　黄磷、砷对肝酶系统的损害特点及其机制　Mg2+-ATPase活性主要分布在胆小管，其次为线粒体，核膜及质膜。本组砷染毒2周，中央带Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更为明显；10周开始回落，12周酶活性下降明显；而周围带持续下降。光镜下发现，2～4周中央带肝细胞浊肿变性；电镜下线粒体肿胀，嵴膜完整清晰，胆小