嗜热厌氧乙醇杆菌——大肠杆菌穿梭载体的构建.pdfVIP

第一章 综述 第一章 综述 1.1 染色体外独立的遗传物质——质粒 质粒是细胞内存在于染色体外裸露的遗传物质(DNA)，凡是质粒都具有复制 原点，从某种意义上讲，它本身就是 1 个复制子[1] ，能在细胞内独立地自我复 制。质粒复制的时间取决于原点的性质，如果质粒原点与主染色体原点相同，则 与主染色体复制同时进行，一般在 1 个细胞周期内只复制 1 次，在这种情况下， 质粒在细胞内的数量一般较少，称为严紧型质粒(stringent plasmid) ；而如果质粒 有自身特异的原点，则可自主地在一个细胞周期内多次复制，造成在细胞内数量 较多，可达几十个以上，称为松弛型质粒(relaxed plasmid)[2] 。由于质粒能复制， 所以在细胞中较稳定地存在，但由于缺乏均等地分配到 2 个子细胞中去的机制， 所以有时可以从某些细胞中丢失。质粒的丢失并不对细胞发生致命的影响，证明 质粒并不是细胞生命活动所必需的遗传物质，但在某些特殊的环境条件（例如存 在抗生素或重金属离子等）下，质粒却是细胞生存所不可缺少的，这是因为质粒 上携带抗性基因。质粒普遍存在于细菌等原核生物中，但最近在真核细胞例如酵 母、丝状真菌等高等动、植物细胞内都发现有质粒或类似质粒的物质存在。有些 质粒可存在于真核细胞的线粒体或质体中[3] 。 1.2 质粒的种类 质粒又分为天然质粒和人工构建的质粒两种。天然质粒包括细菌质粒、酵母 质粒、P 元件。细菌质粒按其所携带基因的功能不同，可分为致育质粒（即 F 质 粒，与细菌的结合有关）、抗性质粒（即 R 质粒，与抗抗生素、药物、重金属 或射线等抑制生长因素有关）、Col 质粒（能编码大肠杆菌素或弧菌素等蛋白质 以杀死其它敏感细菌）、降解质粒（能降解甲苯或水杨酸等一些有毒大分子）、致 病质粒（如 Ti 质粒，能引起植物肿瘤）和隐秘质粒（能发现其存在，但功能不 [4] 明）等多种 ；按其是否能介导其本身细胞间接合性的自我转移，可分为两类， 一类是接合或可转移质粒，所有 F 与 F’ 质粒、许多 R 质粒及部分 Col 质粒均 属此类。另一类是非结合或不可转移质粒。有些质粒不仅可以独立于主染色体外 作为自主性的遗传因子存在，而且可插入染色体中作为染色体的一部分存在，这 一特征更有利于用作基因工程载体。酵母质粒存在于真核细胞酵母菌 1 第一章 综述 Saccharomyces 中，这种质粒称为 2 μm 质粒，约 6, 300 np ，目前人们已将其 [5] 与大肠杆菌中的质粒构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒 。 P 元件是存在于果蝇细胞中一种类似质粒行为、可移动的遗传元件，其大小不一， [5] 人们希望将其改造成为动物基因工程的载体 。 对天然质粒的研究，使人们设想改造这些质粒利用于转基因工作中。转基因 这一术语是 Doy 等在 1973 年铸定的，当时用以说明通过病毒的介导将细菌细 胞中的遗传信息人工地转移到真核细胞中去[6] 。现在转基因的意义已经有所延 伸，指任何有机体之间相互人工转移基因的工作。比较理想的基因载体必须符合 以下条件： ①分子量愈小愈好。分子量小有许多好处，首先容易找到限制酶单一切割位 点，如果载体上存在两个以上酶切位点，酶切时容易将其切成数段，不便操作； 其次是便于装入更多的外源 DNA ；第三是便于进入细胞。 ②质粒上应带有可供选择的基因，进入