第21章常用分子生物学技术的原理.ppt

基因诊断和基因治疗 第九节 Gene Diagnosis and Gene Therapy 定义 直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 一、基因诊断(Gene Diagnosis) 特点 ①以基因作为检查材料和探察目标，属于“病因诊断”。 ②针对特定基因，特异性强。 ③所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。 ④适用性强，诊断范围广。 DNA序列分析 用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断 。 PCR技术 快速检出样品中的痕量病原微生物。 微量DNA 样品中的基因及基因变异分析。 用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。 样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。 同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。 分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。 分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。 基因芯片(gene chip) 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用,以治疗疾病的方法，称为基因治疗。 二、基因治疗(Gene Therapy) 定义 （一）基因治疗的基本策略 缺陷基因精确的原位修复基因增补 基因失活 基因疫苗 基因矫正 基因置换 （二）基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 病毒载体 非病毒载体 体细胞 生殖细胞 间接体内疗法 直接体内疗法 第四节 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有?噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。 基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库 第五节 生物芯片技术 Biological Chip Technique 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 基因芯片工作流程示意图 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 二、蛋白质芯片 蛋白质分子间的亲和反应 蛋白质芯片(protein chip) 蛋白质芯片作用原理 第六节 生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 放射自显影 未结合探针 结合有