基因工程的基本操作详细程序.pptVIP

书P8 (一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因文库的构建模式图 (一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 (一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。 原核生物 真核生物mRNA的形成 基因表达的计算 在真核生物中，对应的是 的碱基数 基因文库的构建 建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。 如果一个哺乳动物的基因组是 3×109碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的 DNA片段在技术上是很困难的。 但是在基因文库中，不同的 DNA片段都分别在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简单的工作。 （二）利用PCR技术合成DNA 1.从基因文库中获取目的基因。 书P8 5.基因表达载体的组成： ①目的基因： ②启动子： ③终止子： ④标记基因： 书P8 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 该法又称粒子轰击、高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术 。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。 对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。但成本高。 　这是我国科学家独创的一种方法。在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 显微注射法是目前最常用的建立转基因动物的方法之一，利用显微操作系统和显微注射技术直接将重组DNA分子以微注射的方式导入单细胞卵的原核中，使其发育成转基因动物的一种方法。 通过此法已经产生了转基因小鼠、兔、猪、绵羊、山羊和奶牛。 显微注射法存在整合率低、成本高、基因只能加入、整合是随机的、转基因的表达不确定、随机整合可能破坏重要的内源性DNA序列或激活细胞的致癌基因、不能在胚胎早期确定性别等缺点。? 感受态细胞：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 CaCl2法： 1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。 2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 以上步骤完成以后，在全部受体细胞中，真正能够摄入重组ＤＮＡ分子的受体细胞很少，必须通过一定的手段对受体细胞是否导入了目的基因进行检测。检测方法有很多种： 书P8 首先： 其次： 最后： 还要： DNA分子杂交技术 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。 (08山东卷) 为扩大耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中 处，DNA连接酶作用