毛开荣牛结核病防控20130815北京.ppt

谢谢 * * * 肩前、股前、腹股沟、颌下、咽、颈 * 里边的小屋子里，也发出一阵咳嗽。 * * * 病原检测 染色镜检 培养特性 动物试验 生化试验 分子生物学诊断 染色镜检 涂片 先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白， 甘油蛋白的配制：鸡蛋白20mL，甘油20mL，水杨酸钠0.4g，混匀。 如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，用二甲苯或乙醚脱脂1－2分钟后倾去，再滴加95％酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。 然后吸取标本滴加其上，涂布均匀。 萋－尼氏抗酸染色 涂片后，经火焰固定 加石炭酸复红染色液 用100mL 95％酒精加3g碱性复红配制成碱性复红饱和酒精溶液，取碱性复红饱和酒精溶液10mL，与5％苯酚溶液90mL混合后用滤纸滤过 将玻片在火焰上加热至出现蒸汽（不能产生气泡），如此热染5分钟（如染色液干涸，须加适量补充）。 水洗后滴加3％盐酸酒精脱色30－60秒（至无色素脱下为止） 浓盐酸3mL，95％酒精97mL，混匀。 水洗后，以骆氏美兰染色液复染1分钟。 甲液：美兰0.3g，95％酒精30mL。乙液：0.01％氢氧化钾溶液100mL。混合即成 水洗，吸干，镜检。 抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成兰色。 菌体形态 牛结核分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5-5微米，宽0.2-0.5微米. 在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体，偶而可见长达10微米或更长 培养 将经过处理的被检样品标本接种到培养基上（同时作2－4份）培养一天后，以熔化的石蜡封口，继续培养。 牛型结核分枝杆菌生长缓慢，初次分离培养时，需36－37℃培养5－8周方可出现菌落。在固体培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1％的丙酮酸钠能促进生长。若是非典型分枝杆菌，则生长较快，大部分（但不是全部）产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。 BACTEC培养法 利用放射性测定技术与培养技术相结合的一种技术。 BACTEC培养法商品盒试剂。 本方法的优点是：比标准培养法检测到的菌量更低，培养时间更短（只需2～8周左右）。 本法的缺点是：费用高，需专用仪器，需防止放射性污染。 用动物分离 豚鼠和家兔对牛型结核分枝杆菌敏感，鸡对牛型结核分枝杆菌不敏感。 处理过的病料，皮下或肌肉、腹腔内注射 接种后30天左右，进行禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素皮内变态反应试验 如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。 如果为阴性反应，可于40天左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 动物试验 试验动物 豚鼠 兔 鸡 牛型结核分枝杆菌 易感 易感 不易感 禽型结核分枝杆菌 不易感 易感 易感 人型结核分枝杆菌 易感 不易感 不易感 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 生化试验： 生化试验类型 烟酸试验 吐温80水解试验 耐热接触酶试验 硝酸盐还原试验 尿素酶试验 T2H抗性试验 牛型结核分枝杆菌 － － － － ＋ － 禽型结核分枝杆菌 － － ＋ － － ＋ 人型结核分枝杆菌 ＋ ± － ＋ ＋ ＋ 分子生物学诊断 DNA针 扩增从临床样品提取的靶序列，是来自热休克基因，大小为402碱基对(bp)片段，336bp和123bp为重复片段，或者单独插入对结核分枝杆菌特异的IS986、ISl081序列。 PCR 报道PCR能区别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。在实际应用中，需要进一步评价其特异性，特别是敏感性。 扩增片段可以看得见，可用生物素或地高辛代替同位素进行标记。 免疫学试验 结核菌素皮内变态反应试验 全血试验 淋巴细胞增生试验、Υ－干扰素试验 血清学试验 ELISA、胶体金 结核菌素皮内变态反应试验 用结核菌素进行的皮内变态反应试验是检查牛结核病主要方法。亦是OIE指定国际贸易用检测试验。试验分2种，一种是牛型结核菌素单一试验，仅用牛型提纯结核菌素进行，目的是检测是否存在牛型结核分枝杆菌的感染。另一种是结核菌素比较试验，用牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素同时进行，这是一种鉴别诊断试验，用以明确是牛型结核分枝杆菌感染，还是禽型或副结核分枝杆菌或其他分枝杆菌感染。 PPD皮试操作流程 剃毛 颈侧中部上三分之一 测量皮皱厚,记录,标记 皮内注射结核菌素 PPD稀释成2万单位/ml,注射2000单位/0.1ml 测量皮皱厚,记录,标记 72小时 75%酒精消毒术部; 左手捏起皮肤，右手持针管; 将针头与皮肤成30-45°角刺入表皮与真皮之间，缓慢注入药液; 以局部形成丘疹状隆起为准。 皮试工