分子生物学的基本操作.pptVIP

第一章 分子生物学的基本操作 分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的最主要原因—— 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 知识回顾——核酸的化学组成 碱基 嘧 啶 核 苷 磷酸 核苷酸的连接方式 1.3 基因扩增 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72oC Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification 在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 1.5 基因工程载体 质粒载体DNA的分离——碱裂解法 碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。 在pH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH恢复至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。 1.5.2 重要的大肠杆菌质粒载体 1.5.2.1.? pSC101质粒载体 1.5.2.2.??ColE1质粒载体 ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。在正常生长条件下，当培养基中用于蛋白质合成的氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。此时，松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000~3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。由此可见，由于质粒拷贝数高，插入的外源DNA片段的产量也就得到相应的提高。 ??? 思考题 ———借助PCR手段完成 本章要点 分子生物学操作常用工具酶的作用 细菌转化 PCR 基因工程载体 重组子筛选方法（pBR322、pUC18/19) 复习题 细菌转化操作流程 PCR原理与步骤 基因工程载体的特点 ??? 第一，更小的分子量和更高的拷贝数。 ??? 第二，可用组织化学方法检测重组体。 pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。 ??? 第三，具有多克隆位点(MCS)区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRⅠ和HindⅢ）的外源DNA片段直接克隆到pUC18/19质粒载体上。 pUC质粒载体优点： ________外源DNA片段定向插入载体分子 ? 若用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化一种特定的DNA分子，将产生具有两种不同粘性末端的DNA片段。因此，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对限制性核酸内切酶切割，那么，载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子，从而保证外源DNA片段定向插入载体分子。 思考题:如何在特定基因的两端引入限制酶识别位点? General process of gene engineering 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DN