免疫电子显微镜操作方法介绍.docx

PAGE \* MERGEFORMAT13 免疫电子显微镜操作方法(Pre-embedding法) 所用溶液的配制方法 0.4M PB贮存液 注意：用超纯水（milliQ水）配制。 pH=7.3-7.4 Na2HPO420.6g41.2gNaH2PO4?2H2O5.2 g10.4 g500 ml1000 mlNa2HPO4?12H2O52 g104 gNaH2PO4?2H2O7.2 g14.4 g500 ml1000 ml 流程 组织的固定 固定液洗净（梯度蔗糖置换） 冰冻切片制作 抗原抗体反应（一抗、二抗） 前固定 1-2.5% glutaraldehyde （戊二醛） 银增感反应（暗室） 后固定（锇酸） 包埋块染色 （醋酸铀） 酒精系列脱水 树脂包埋 聚合 修块 超薄切片 电子染色 观察  冰冻切片 制作冰冻切片。厚度通常是10um 冰冻切片放入切片架，用吹风机吹干（冷风）。 取出余下的冰冻包埋块，用铝箔纸包好，放-80度保存。 吹风机30分钟以上吹干。之后开始进入抗原抗体反应步骤 暂时不用的冰冻切片，放入硅胶（干燥用），完全密闭（自封袋，封口膜等）后置于-80度保存。下次使用前，升至室温后再开封（防止生成水气）。 抗原抗体反应 用镊子将多余的冷冻包埋剂剔除。 用免疫组化笔圈住组织 放入0.1MPB中浸洗，室温，5分钟 Blocking solution, 室温，20分钟 1% BSA， 10%正常血清（与二抗同种动物），0.005% saponin， 0.1M PB 或 5% 正常血清 + 0.2% Triton X-100 + 0.1M PB 一抗用blocking solution稀释（约1-2ug/ml），室温孵育1h后，4度下2-3夜。 0.1M PB 4次x10分钟 金标二抗in blocking solution（1.4 nm colloidal gold，nano probe公司，50-100倍稀释），室温孵育1h后，4℃, 2夜。（参考文献附后） 下面进入银加强反应。  银加强反应包埋 试剂准备： silver enhancement kit（购自Nanoprobes）。放入-20度保存前，tube内分装保存。使用当天早上从-20度冷柜中取出，至室温后使用。全程遮光。 25 % gultaraldehyde (戊二醛)/0.1 M PB， 贮存使用。 洗净二抗：0.1M PB 10min X 4次 （PB绝对要使用MilliQ水。银反应过程中有Cl-不可。） 前固定： 1 % gultaraldehyde (GA，戊二醛)/0.1 M PB， RT 5～10 min （25%GA 40ul + 0.1M PB 960ul） 洗净 0.1M PB 10min X 2次 洗净 MilliQ水（超纯水），5min x 3次 银加强反应： 要准备的试剂、物品等 已经从-20度升到室温的silver enhancement kit 暗室（现在的显微镜室，门上遮挡，注意反锁） 桌上型漩涡仪（vortexer） 纸毛巾（吸水，不易破） 15ml试管 1ml的移液器和枪头 大的玻璃瓶（装废水用） 玻璃瓶或烧杯（装MilliQ水或超纯水 500ml-1000ml） 银加强反应（暗室内进行） 桌上铺上纸质毛巾（吸水性强）、注意sliver enhancement kit试剂各瓶的编号。 打开安全灯。 按照每张切片kit内每种液体50-100ul的量，按红、白顺序放入15ml食管，vortex。 将切片上多余的水分吸干后，将切片铺在纸质毛巾上（注意防止切片干燥） 步骤3的试管内加入kit内的蓝色液体，vortex。 将混好的反应液4-5滴加在切片上（覆盖全组织）。 反应时间各季节有所差别：冬季（室温15度以下）14-16min； 春秋季（RT15-20度）12-14min； 夏季（RT20度以上）8-10min。暗室中的温度一般情况下比较高，冬天7-10min，夏天3-5min即可。 7. 用超纯水洗 3-4分 8. 镜检。染色较淡的情况下，再进行一次增感反应。 接下来的步骤需要在电镜室完成（要准备1ml移液器和枪头）。 事先配制3%锇酸stock和0.2M PB stock，放入4度冰箱内保存。 后固定（准备湿盒）： 1. 排风橱内。1.5ml EP管。3%锇酸stock和0.2M PB stock以1：1混合，制成1.5%锇酸/0.1M PB。1张切片100ul的量。 2. 密闭的湿盒内4度，1小时。完全密闭（parafilm封闭湿盒，再用密封袋封闭）。 3. MilliQ水（超纯水）洗净。5min x 2次。 Block staining（事先配制醋酸铀