南开大学（冯喜增）结构生物学sturcture biology-第七讲-2-电子显微学在结构生物学研究中应用2.pptVIP

电子显微学在结构生物学研究中的新进展 结构生物学 冯喜增 教授 电子显微学是结构生物学的重要分支,已经成为一种公认的研究生物大分子、超分子复合体及亚细胞结构的有力手段。 本文先回顾了近期电子显微学在技术上的新进展,后概述了生物电子显微学的三个组成部分———电子晶体学,单颗粒技术,电子断层成像术的基本原理,技术方法与研究现状。 最后,对电子显微学与其他结构生物学研究手段的结合以及电子显微学的未来发展做了简单的展望。 随着人类基因组计划的初步完成和一系列模式生物全基因组计划的完成,生物学进入了后基因组时代。 虽然大量的基因序列被阐明,但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装,形成有功能的结构单元,尚需进一步研究。 而揭示生物大分子在细胞和细胞器中的排列与相互作用,则是人们理解细胞活动的必经之路。以X 射线晶体学、核磁共振技术(NMR) 、电子显微学、计算生物学为基本研究手段的结构生物学显然将在其中扮演越来越重要的角色。 电子显微学是通过电子显微镜技术并结合图像处理技术发展起来的,在直接提供生物大分子的形貌信息上具有很大的优越性。 电子显微学在本质上有提供原子分辨率的能力,但由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度低、信噪比低的特点,使其对生物大分子的高分辨率结构解析非常困难。 1968 年,DeRosier 和Klug 第一次用电子显微镜对生物大分子的结构(T4 噬菌体的尾部) 进行了解析[1 ] 。 在随后的35 年里,随着生物大分子样品制备技术的完善,电子显微镜在设备和技术上的进步,计算机与图像处理技术的发展,使得应用电子显微镜对生物大分子进行结构解析的方法日益成熟,并逐渐发展成为解析生物大分子空间结构的重要学科—生物电子显微学。 目前电子显微学已经成为一种公认的研究生物大分子、超分子复合体及亚细胞结构的有力手段。 生物电子显微学相对于其他两种成熟的结构生物学研究手段———X 射线晶体学和核磁共振技术, 主要有以下一些优势: 1. 可以直接获得分子的形貌信息,即使在较低分辨率下,电子显微学也可给出有意义的结构信息; 2. 适于解析那些不适合应用X 射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品,如难以结晶的膜蛋白,大分子复合体等; 3. 适于捕捉动态结构变化信息; 4. 易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息; 5. 电镜图像中包含相位信息,所以在相位确定上要比X 射线晶体学直接和方便。 本节首先介绍近年来生物电子显微学在研究技术方法上的发展; 其后将对三种主要方法:电子晶体学、单颗粒技术及电子断层成像术的主要原理、技术 方法、研究现状分别做简单介绍,并列举相应的实例说明; 最后介绍电子显微学和其他结构生物学研究手段的结合,以及展望。 希望更深入了解电子显微学的读者,可以参考文献[2～6 ] 。 1 　电子显微学技术进展 用电子显微学研究生物大分子的结构必须解决以下几个问题:保持样品的天然含水状态;尽量减少样品漂移及辐照损伤,提高图像衬度,提高信噪比。 首先,低温电子显微术(electron cryomicroscopy)的出现及完善使得人们对天然状态的样品研究成为可能,且能提高样品对电子辐照的耐受度,有效地提高了分辨率。 冰冻电镜的开创性工作是由Taylor 和Glaeser[7 ]首先建立的,经过近二十年的发展,尤其是得益于Dubochet 实验室对冰冻技术深入系统的研究[8 ] ,冰冻技术已经成为高分辨电子显微学研究的常规技术。 它包括冰冻制样技术、低温冷台技术和低剂量曝光技术。 主要步骤是把含水样品快速冷冻,使之包埋在玻璃态的冰中(vitrification) ,然后将冰冻样品转移到液氮或液氦冷却的低温冷台进行电镜观测。 对于冰冻样品的观察、聚焦、拍照要在低剂量模式下进行。 因为温度越低,样品所能承受的电子辐照量越高,所以目前最高分辨率的电子显微镜已应用液氦冷却[9 ] 。 另一个最近发展起来的技术是底物混合冰冻技术( spray - freezing) [10 ] 。 利用这种技术可以把两种溶液在极短的时间内混合起来(几个毫秒) ,然后快速冷冻。这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定。 其次,电子显微镜性能的不断提高和各种新技术的应用也推动了电子显微学对生物大分子结构的研究。 场发射电子源在新一代的电子显微镜中得到了广泛的应用。这种电子源发射的电子相干性更好,信号失真更小,从而有效地提高了图像衬度。能量过滤器的配备,能去除非弹性散射电子,从而减小背底噪音。 更高精度和更大倾转角度的样品台使之能够收集尽可能完整的空间结构信息。 点扫描成像技术的应用,能够减小电子束造成的样品漂移,从而有效提高了信噪比[11 ] 。 CCD 相机在电子显微镜上的广泛应用使得实时拍摄图像,