RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响.docVIP

RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响 作者：曾达武， 方明霞， 刘豫瑞 【摘要】 目的 研究针对分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡影响的可能机制。 方法 阳离子脂质体法介导si-Id-1转染ESCC TE-1细胞株，倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并 计算 转染率，RT-PCR检测Id-1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Id-1的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后TE-1细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。 结果 si-Id-1转染前后的TE-1细胞株Id-1的mRNA和蛋白表达水平有明显差异(P0.05);转染后的TE-1细胞较其亲代细胞增殖能力降低，凋亡程度增强(P0.05);转染后的TE-1细胞周期停滞在G0/G1期，G1期细胞数增多，S期细胞数减少(P0.05)。 结论 利用脂质体将si-Id-1转染至ESCC的TE-1细胞是切实可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1细胞Id-1的表达，从而抑制ESCC细胞增殖。 【关键词】 抑制因子，免疫; 癌，鳞状细胞; 食管肿瘤; RNA，小分子干扰; 细胞凋亡; 细胞增殖 在我国，食管癌具有高发病率及高病死率，以手术为主辅以放射 治疗 或化学治疗的综合治疗可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于转移和局部复发[1]，因此寻求新的切实有效的食管癌治疗方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitor of DNA binding or differentiation, Id-1)可在食管癌、肝癌等肿瘤中表达，参与肿瘤血管发生、促进肿瘤生长及转移[2-4];而小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可有效沉默目标基因，而不影响正常基因[5]。该研究针对si-Id-1对人食管鳞状细胞癌(ESCC)TE-1细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，探讨其对ESCC增殖和凋亡影响的可能机制。 　 　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(广州锐博生物公司)，人食管鳞状细胞癌ESCC TE-1细胞(上海拜力生物公司，ATCC来源)，Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗体、Western印迹荧光试剂(美国Santa Cruz公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁株氏会社产品)，Taq酶(北京天庚生化公司)，Annexin V/PI凋亡试剂盒(美国Beckman公司)。 　　1.2 分组 空白对照组：正常培养TE-1细胞组;转染试剂组：仅加入Lipofectamine 2000组;转染对照组：转染非特异性序列NContml-05815的细胞组;转染实验组：转染si-Id-1组。 　　1.3 方法 　　1.3.1 TE-1细胞培养和脂质体介导的siRNA转染效率 ESCC TE-1细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液，于37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。以105 mL-1的细胞密度接种培养，细胞80%融合后，用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。3组siRNA均由广州锐博生物公司设计与合成。 　　Si-Id-1-001(19 bp)： 　　5’-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT-3’ 　　3’-dTdT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5’ 　　Si-Id-1-002(19 bp)： 　　5’-CAU GAA CGG CUG UUA CUC A dTdT-3’ 　　3’-dTdT GUA CUU GCC GAC AAU GAGU-5’ 　　Si-Id-1-003(19 bp)： 　　5’-GUU GGA GCUGAA CUC GGAA dTdT-3’ 　　3’-dTdT CAA CCU CGA CUU GAG CCUU-5’ 　　另外，本实验还将标记FAM的siRNA同时转染至TE-1细胞，分别于转染6，24，48和60 h后通过荧光倒置显微镜观察含有荧光的细胞所占比例以及转染前后的细胞形态变化，据此估计siRNA的转染效率。 　　1.3.2 RT-PCR检测Id-1的mRNA表达 用Trizol一步法提取TE-1细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测纯度并定量。然后以mRNA为模板，Oligo(dT)18为引物，逆转录成cDNA，反应总体积为20 μL，RT-PCR反应条件为42 孵育60 min，70 中止10 min。Id-1的PCR反应引物由上海