The MIQE Guidelines-MIQE指南.pptx

钟艺 2014.12.15 P C R MIQE指南：发表实时荧光定量PCR实验所需提供的最低信息量 背景 缺乏共识 细节不够 目的 使作者能够设计和报告更有价值的qPCR实验。 使评阅人员和编辑按照相应的标准来评价所提交的文稿的技术质量。 使读者更容易重复按照该指南发表的实验研究。 学术术语 qPCR——实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR） RT – PCR——反转录PCR（Reverse Reaction PCR） 标准化基因——参照基因（reference genes） TaqMan探针——水解探针（Hydrolysis Probes） FRET探针——荧光共振能量转移探针 LightCycler型探针——双杂交探针 定量——quantification 循环数——Cq（quantification cycle） 概念 分析灵敏度：单次分析中能够准确测定的样本的最小拷贝数（浓度），区别于临床灵敏度。 分析特异性：qPCR分析在样本中有其他物质存在时只检测目标序列的能力。区别于诊断特异性。 准确度：实验测定浓度与实际浓度的差异，以差异倍数和拷贝数的估计值表示。 重复性（短期/批内）：同一方法分析同一样本的精密度和耐用性，Cq的变异。 重现性（长期/批间）：批间结果或不同实验室间结果的变异，拷贝数的变异。 描述目标基因mRNA浓度：RT-PCR分析+引物序列信息、引物相对于特定剪接变异体的特异性评价信息、有文件证明的转录过程中单核苷酸多态性的位置信息、使用的单核苷酸多态性数据库。（RTprimerDB） mRNA浓度 ≠ 蛋白浓度 研究和诊断 研究样本：来源广泛、低通量、样品类型不同 诊断样本：数量有限、高通量、样品类型少 样本的采集、处理和制备 待测目标为RNA——组织样本的采集来源、是否立即处理、保存时间、保存条件； 简单描述样本：肿瘤显微镜活检——活检标本中肿瘤细胞组成的百分比。 核酸提取：提取方法、测定浓度的方法、质量评价方法 核酸的质量控制——RNA样本 RNA样本：保证各样本中含有大致相同量的RNA 检测和报告全基因组DNA的污染程度 RNA样品是否已经过RNA酶处理（酶类型及反应条件） 核酸目标在阳性质控品和NTC下Cq值的比较 RNA模板的质量评价——数量、污染情况、完整度 A260/280——中性PH的缓冲盐 测定mRNA浓度微小（10X）差异：凝胶电泳 DNA样本：阳性质控——检测抑制作用 反转录 实验方案和试剂 RNA量、引物、酶的类型、酶的用量、温度、反应时间 2~3次重复（相同RNA浓度） qPCR 每个目的基因和对照基因的数据库检索编号 每个引物和探针的外显子位置 寡核苷酸的序列和浓度（染料或被修饰的碱基的性质、位置和连接） 聚合酶的浓度和性质 模板DNA或cDNA的量 镁离子的浓度 缓冲盐的化学组成（盐、PH值和添加剂）及反应体积 qPCR仪和循环条件 器材制造商 塑料器皿透明度（白色/透明） 密封方式（热合/粘合） qPCR 二级结构：mfold 特异性：BLAST，验证（电泳凝胶、解链曲线图形、DNA测序） 引物优化：退火温度和镁离子梯度、Cq值、荧光点数对比循环次数和溶解曲线 质控品和定量校准品：每一块反应板都要有NTC并确立数据排除标准 分析性能：PCR的效率——校准曲线法（斜率、Y轴截距） 线性动态范围——平均校准曲线法，动态范围至少跨越3个数量级，浓度范围达到5~6个log10浓度，线性区间包括目标核酸的定量范围，报告最低浓度的变异与相关系数（R2值），提供整个线性动态范围内的CI（可信区间）值。 检测限：能够检测到95%的阳性标本的最低浓度。 精密度：进行多次重复测定，并标示重复性（SD）和可信区间。对于诊断分析还需报告不同地点和不同操作者的批间精密度（重现性）。 多重qPCR：需证明在多重PCR下的分析效率及LOD与单一PCR反应下相同。 数据分析 提供数据分析方法和置信限评估的详细信息及分析软件的性能指标。 标准化：参考基因的选择优化及最佳数量 不提倡采用单一参考基因，除非能证明其在所述实验条件下没有表达差异。 报告目的基因参考基因mRNA浓度的比值，参考基mRNA应该有稳定表达，且丰度与样本中mRNA总量有较强相关性。 生物系统固有变