检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19、CEA mRNA的临床意义.docVIP

检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19、CEA mRNA的临床意义 【摘要】 目的 观察细巢式逆RTPCR检测老年胃癌患者腹腔冲洗液瘤细胞胞角蛋白19(CK19)、癌胚抗原(CEA)的临床价值。方法 收集45例进展期老年胃癌和8例胃良性病变患者腹腔冲洗液200 ml，其中100 ml行RTPCR检测CK19、CEA　mRNA，另100 ml用于HE染色细胞学检查，胃癌细胞SGC7901为阳性对照。结果 45例老年胃癌病人腹腔冲洗液中CK19 mRNA的阳性表达率为55.6%(25/45);CEA mRNA的阳性表达率为51.1%(23/45);CK19、CEA mRNA的联合检测阳性率为62.2%(28/45)。细胞病 理学 检查45例胃癌病人有8例腹腔冲洗液中发现肿瘤细胞，阳性率为17.8%(8/45)，且此8例CK19、CEA mRNA检测结果均为阳性。CK19、CEA mRNA阳性率与肿瘤胃壁浆膜受侵、淋巴结转移和胃癌分期明显相关(P0.05)。结论 腹腔冲洗液中CK19、CEA mRNA检测胃癌细胞敏感性高。初步临床观察显示此方法对于早期诊断胃癌患者腹腔种植有一定价值。 【关键词】 胃癌;细胞角蛋白19;癌胚抗原;腹腔冲洗液 近年来老年胃癌病人逐渐增多，目前多采用以手术为主的根治术，但发现时多属中晚期故预后仍较差。影响预后的主要因素之一是腹腔转移，腹腔脱落癌细胞(ECC)是腹膜转移之源〔1〕。因此早期检出ECC，及时采取有效的干预措施，是改善胃癌病人预后的关键。由于脱落的游离癌细胞数量少，浓度低，使得传统的细胞学检查(CY)阳性率低，有很高的漏诊率〔2，3〕。细胞角蛋白19(CK19)在胃癌腹腔转移灶中的表达却存在争议。以往巢式RTPCR技术检测CK19、癌胚抗原(CEA) mRNA已成功地运用于胃癌淋巴结、骨髓及血液微转移的研究，国内外少见用于胃癌腹腔微转移的研究，尤其关于老年患者更无报道。本研究采用巢式RTPCR技术检测老年胃癌患者腹腔冲洗液中瘤细胞CK19、癌胚抗原(CEA)mRNA的表达，探讨其对早期诊断腹腔转移的临床实用价值。 　 　1 材料与方法 　　1.1 检测对象 标本来源于本院2006年9月至2007年2月接受手术的45例老年胃癌病人，均经手术及病理证实。其中男性29例，女性16例，年龄60～76岁，中位年龄66岁。临床病理学特征：45例中大体浆膜受侵18例，病理累及浆膜31例，组织学类型高中分化28例、低分化17例，淋巴结有转移26例、无转移19例，病理分期+Ⅱ期21例、+Ⅳ期24例。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本制备 开腹探查腹腔后，于Douglas窝或左膈下置入一根16号导尿管，注入200 ml无菌生理盐水，在不触动原发灶的情况下，轻轻搅动后吸出，如有 自然 腹水则直接吸出。所有标本均分成两部分，一部分送本院病理室行细胞学检查。2 500 r/min离心10 min，弃上清液，沉渣涂片，HE染色后镜检。另一部分立即于4下2 500 r/min离心10 min，弃上清液，置-80冰箱备用。 　　1.2.2 mRNA提取 采用mRNA抽提试剂盒(B.M公司)提取腹腔冲洗液离心沉渣mRNA，采用PrimeScriptTMRTase,2Step RTPCR试剂盒(宝生物工程有限公司)行逆转录。操作步骤按照试剂盒说明书进行。 　　1.2.3 巢式PCR扩增CK19、CEA产物 宝生物工程(大连)有限公司合成引物序列。CK19 mRNA巢式PCR引物〔4〕：A,5′AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC3′;B,5′TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC3′;C,5′TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC3′;D,5′CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC3′。CEA mRNA巢式PCR引物〔5〕：E,5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′;F,5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′;G,5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′。内对照βactin引物序列〔6〕：上游引物：5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′;下游引物：5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′。PCR按说明书反应分两步，第一步模板为反转录的产物cDNA，CK19 mRNA的引物为A、B,CEA mRNA的引物为E、F。反应条件：94变性30 s，57退火30 s，72延伸30 s，30个循环。第二步取第一步扩增产物2 μl，CK19 mRNA的引物为C、D，CEA mRNA的引物为F、G，以同样步骤扩增30个循环。