Westernblot原理和技术上课.pptVIP

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  • 2017-05-21 发布于广东
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Westernblot原理和技术上课

* 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触,使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比,这种方法又快(15-45 分钟)又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统,可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而,半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。 半干转操作步骤与湿转基本类似,区别在于两边都是3层Whatman 3#滤纸,转移电压和时间也有所不同。 半干转移系统中,滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要,这样电流必须通过凝胶。否则,在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡,气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”(即非转移区)。 小分子量的蛋白半干转效果比较好,大分子量(100KD以上)建议湿转。 * 转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST(或PBST)中漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用,若是使用呈色反应的酶检测法时,印

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