荧光定量PCR2013528徐歆改.pptVIP

实验七 荧光定量PCR 简 介 荧光定量PCR扩增曲线 荧光定量PCR扩增曲线并非标准的指数曲线，而是S形曲线，并可分为反应早期、指数期和线性期和平台期。 即使是重复实验，保证各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也有所不同 PCR结束后的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况 Ct值与DNA模板 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，CT值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 非特异性荧光标记 SYBR Green I 游离状态荧光很弱，但与DNA双链结合后荧光强度增加1000倍！ 其信号强度代表了双链DNA分子（即PCR产物）的数量 熔解曲线分析引物二聚体 5’端标记有报告基因（Reporter，R），如FAM、VIC等 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针 绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度 相对定量：在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化 拷贝数的计算 样品DNA浓度（ng/μ