生物工程上游实验报告.docxVIP

利用不同的方法筛选和鉴定转化子作者:XXX学院:生命科学学院班级:XXXX学号:XXXXX同组人员:XXX摘要:本实验通过使用限制性内切酶切割质粒，用定向克隆的方法相连，并转化到大肠杆菌中，然后对转化产物进行了筛选和鉴定.从所得的五个转化子中，经过PCR、琼脂糖电泳鉴定，摇瓶发酵，观察是否有绿色荧光蛋白基因筛选出有重组质粒的大肠杆菌.关键词: PCR 酶切重组质粒大肠杆菌凝胶电泳1 引言质粒具有稳定可靠和操作简便的优点.在实际工作中，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒.同时，细菌的转化效率极低，进行转化后，绝大部分细菌是没有被转化的.因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定.首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子.因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以，将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落.其次，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子.但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果.因此有必要进一步进行鉴定.从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。2材料与方法2.1 材料:实验九所得转化子2.2 设备用具：PCR仪，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像系统装置，三角瓶电热恒温培养箱，电泳仪，超净台，移液枪，1.5mL离心管2.3 试剂rTaq酶：10×PCR buffer；dNTP mixtures(10mM)前向引物P1：5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAG-3’反向引物P2：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACACAAA-3’限制性核酸内切酶HindⅢ；；ddH2O；限制性核酸内切酶缓冲液:10×M buffer，0.5×TBE buffer；EB母液；质粒提取试剂；酶切试剂；酶反应终止液；1%琼脂糖；无菌蒸馏水；6×loading buffer；矿物油.LB液体培养基配方:称胰蛋白胨7g，酵母提取物3.5g，NaCl7g于1000ml的三角瓶中，加入700ml蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH调pH至7.5，加塞，包扎瓶口，高温蒸汽灭菌备用。2.2 方法2.2.1 转化子的筛选选出在实验九中，LB固体培养基上生长出来的白色菌落.选取五个，做好标记.2.2.2 菌落直接PCR用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落，在编好号码的PCR反应管中的底部分别涂抹，然后在PCR管仲配制75μL反应体系.反应体系如下:DNA template buffer 用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹10×PCR buffer 7.5μLdNTP mixture 6μL前向引物(P1) 3μL后向引物(P2) 3μLrTaq酶1μLddH2O 54.5μL（up to 75μL）所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心即可.为了防止反应混合液蒸发，最后添加15μL矿物油.PCR仪的参数设置94℃ 4min94℃ 30s62℃ 30s 35 cycles72℃ 30s72℃ 5min琼脂糖凝胶电泳检测:反应结束后，取10μL产品，加入2μL 6×loading buffer，混匀后点样，电泳15min.观察产物带.2.2.3 质粒提取及大小鉴定:照上述电泳的结果，用无菌牙签从平板上挑选出2个PCR反应阳性菌落，接种于含Amp10μg/mL的10mL LB液体培养基中，37℃下震荡培养24h，观察实验结果，并以别组的结果没有绿色荧光蛋白基因的液体培养基作为阴性对照，对比观察并拍照记录。(附LB液体培养基的配制方法)LB液体培养基配制方法:称取胰蛋白胨7g，NaCl 7g,酵母提取物3.5g于1000ml三角瓶中，加入700ml蒸馏水搅拌溶解，放入高压灭菌锅中灭菌备用，每个同学使用时，每个液体培养基只需要10ml左右。3实验结果3.1 PCR产物电泳图图1菌落直接PCR产物电泳图3.2 液体培养基观察绿色荧光图 2 液体培养基大肠杆菌绿色荧光现象图4实验结果分析4.1 菌落直接PCR结果在上一次的转化试验中，在含有氨苄青霉素的培养基中，有大量的大肠杆菌生长，我从中挑选出5个菌落直接PCR。进行凝胶电泳后，结果如图1所示.图1中，1、3为阳性转化子，2 、4 、5为阴性转化子，因此，5个菌落中