基因工程的基本操作程序C5.pptVIP

§1.2 基因工程的基本操作程序 一、教学目标： 1.简述基因工程原理及基本操作程序。 2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。 二、教学重点： 基因工程基本操作程序的四个步骤。 三、教学难点： 1.从基因文库中获取目的基因。 2.利用PCR技术扩增目的基因。 一、基因工程操作的程序包括： （一）目的基因的获取； （二）基因表达载体的构建； （三）将目的基因导入受体细胞； （四）目的基因的检测与鉴定。 原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。（既是概念，又是原理） 二、基因工程操作程序： （一）.第一步：获取目的基因 （1）获取目的基因的方法： ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③人工合成目的基因课本P11 2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： 检测目的基因是否翻译成蛋白质 　　具体做法是：　　第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；　　第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；　　第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；　　第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；　　第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。　　由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。 实例 1： 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （　 ） A．人工合成基因 　　　　 　 B．目的基因与运载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测和表达 求异思维P8 由mRNA反转录形成cDNA的过程 cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以 RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链 的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 寻根问底P9 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一 种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到 一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 实例 1： 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （　 ） A．人工合成基因 　　　　 　 B．目的基因与运载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测和表达 三、基因工程操作程序： 2.第二步：基因表达载体的构建（核心） （1）目的：P11 （2）以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤： ①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口； ②用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端； ③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使两者结合成重组质粒。 三、基因工程操作程序： （3）基因表达载体的组成： ①目的基因： ②启动子： ③终止子： ④标记基因： 寻根问底P11 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。 三、基因工程操作程序： 3.第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 （2）常用的转化方法　 ①导入植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 操作过程：P12－13 ②导入