实验八植物DNA的提取和种间亲缘关系的分子鉴定.pptVIP

  DNA聚合酶能以单链DNA为模板，合成一个与其互补的新链。将双链DNA加热至接近100℃时，DNA变性，形成两条单链DNA。此单链DNA即可用于合成互补链的模板。然而，新链合成的起始点必须有一小段双链DNA。 PCR反应中，两条人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度下，DNA聚合酶即将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起点，沿模板以5′?3′方向延伸，合成一条新的互补链。引物的位置将决定合成的DNA序列。 PCR反应中，双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温下引物延伸三个步骤反复循环。 每一循环中所合成的新链，又都可以作为下一循环中的模板。 PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增的目的。 ⑶ PCR的反应体系 PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 　① 模板变性温度 变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。 ③ 引物延伸温度 温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。 　　总之，PCR的条件是随系统而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。 　　　 ① 分子生物学研究 基因克隆 反向PCR与染色体步移 不对称PCR与序列分析 RT-PCR与RNA分析 基因的体外诱变与突变的检测 基因组的比较研究 　　基因克隆 在PCR发明之前：突变体?基因文库?探针杂交筛选?结构测定。 ?费时、费力、繁琐。 在PCR发明后：突变体?设计并合成引物?扩增产物?结构测定。 ?快速、简单、高效。 构建重组基因：在引物的5′端加上一段特殊的额外序列。 反向PCR与染色体步移 扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列。 不对称PCR与DNA序列测定 两种引物浓度相差100倍，最终扩增出高浓度的单链DNA。 　　 RT-PCR与RNA分析 主要用于扩增RNA，研究基因表达情况。先将RNA反转录成CDNA，接着以CDNA为模板进行PCR扩增。 　　 　　突变的检测：许多种人类癌症都与癌基因ras的突变有关，使用人工合成的与待分析位点两侧序列互补的寡核苷酸引物，对患者样品作PCR扩增，然后将所得的扩增DNA片段转移到硝酸纤维滤膜（或尼龙滤膜）上，并分别同ras基因全部有用的碱基突变寡核苷酸探针进行杂交。研究结果表明，不同类型的淋巴恶性肿瘤具有不同的ras突变。 　基因组的比较研究 在PCR反应中，如果所用引物较短，所得的扩增产物将是一群长短不一的DNA片段混合物。这种情况虽说对PCR扩增的特异性是不利的，然而在此基础上发展的应用短片断的寡核苷酸引物所作的随机扩增，对于系统发育的研究却是十分有用的技术。重要的一点是，用随机引物扩增出来的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳之后所呈现的带型反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。因此，应用随机引物的PCR扩增能够测定出两