实时定量PCR技术real-timePCR.pptVIP

熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60℃升至95℃，每升高1℃仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。 三、实时定量PCR技术的应用 ?基因突变分析 –单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 ?SNP扫描 –疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定 –SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异 –药物副反应的预防，如麻醉意外 ?物种鉴定、菌株鉴定 –各种病毒，细菌，病毒 –病原体检测，如炭疽菌，E coli. O157 四、常见问题 4.1无 Ct 值（信号）出现 1、反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一 般在退火结束或延伸结束采集信号； 3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。 4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸。 5、模板量少：对未知尝试的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。 6、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。 4.2 CT值出现过晚 1、反应条件不佳：重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加Mg离子浓度等。 2、PCR各种反应成分的降解或加样量不够。 3、扩增产物片段过长：一般采用100-200bp的扩增长度。 4.3 标准曲线的线性关系不佳 1、加样误差，标准品稀释不呈梯度。 2、标准品降解：避免反复冻融。 3、引物或探针不佳，重新设计。 4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 4.4 阴性对照也出现明显的扩增 1、荧光PCR mix或水被污染。 2、引物二聚体的出现：在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。 3、反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。 4.5 熔解曲线不止一个主峰 1、引物设计不佳：二聚体和发夹结构。 2、引物浓度不佳。 3、退火温度过低。 4、Mg离子浓度过高。 5、模板中有基因组的污染。 4.6 扩增效率低 1、反应试剂中部分成分特别是染料降解。 2、反应条件不佳：降低退火温度或三步法。 3、反应体系有抑制物：大多为模板中引入，应先适当稀释模板，再加入到体系中，减少抑制物的影响。 4.7 重复性不好 1、加样不准确。 2、仪器的温度均一性不好。 3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 4.8 扩增曲线不正常 1、基线等设置不当。 2、模板量过多：当扩增曲线在10个循环内起峰时，应稀释100-1000倍后使用。 4.9 荧光定量PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？ 当进入对数期的循环数大于35时，一般认为检测无效，基因没有表达，当进入对数期的循环数在32-35个循环时，需要有至少的个重复才能判断是否能检测到基因的表达。 * * TaqMan定量原理 荧光共振能量转移(FRET) 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 TaqMan MGB探针 能够分辨一个碱基的差别 由于Taqman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。 多重荧光定量 原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色。?特点一次提取DNA/RNA、一次反应得出多个定量结果信号之间要保证互不干扰 ??荧光定量需要ROX校正和IPC校正 ??检材和对照可以在同一管中定量 ??仪器须有多荧光检测能力 ??推荐的4色组合 ??FAM目的基因 ??VIC第二个目的基因或者IPC ??TAMRA淬灭基团 ??ROX参比荧光 1.6 实时定量PCR仪光学结构 二、实时定量PCR技术操作 2.1 定量PCR实验要素 目标基因 未知样品?? 生成标准 曲线标准品梯度?? 监控系统 故障阳性对照?? 监控污染 阴性对照?? 校准生物学误差 管家基因(IPC)?? 校准物理误差