核酶ribozyme.pptVIP

主要讲授内容 一、概述 二、剪接型核酶 三、剪切型核酶 四、核酶的应用 五、核酶技术面临的问题 六、脱氧核酶（deoxyribozyme) 3、核酶作用的特点 化学本质: RNA 底物：RNA 反应特异性(专一性）：碱基 催化效率： 低 产物 二、剪接型核酶 定义：剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)，具有核酸内切酶和连接酶的活性。 分类： I类内含子 II类内含子 1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing) 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系 引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列 5‘CUCUCU3’ 3’GGGAGG5’ 核酶是一种金属依赖酶 金属离子的作用： 1、中和RNA链上的负电荷，增加“刚性”； 2、利用金属离子的鳌合作用发挥空间诱导效应，使核酶和底物形成复杂的空间结构； 3、产生H+，诱导并参与体系的电子或质子传递，催化体系发生催化反应。 2、Ⅱ类内含子的自我剪接 剪接机制 结构与功能的关系 三、剪切型核酶 1、自身催化剪切型RNA 1.1 剪切机制 1.2 结构与功能的关系 锤头结构 (Hammerhead) 发夹结构(Hairpin) 斧头结构(Axehead) 假结样结构(Pseudoknot-like) 1.3 影响核酶活性的因素 六、脱氧核酶的研究 1994年，Breaker等，体外选择技术，发现了切割RNA的DNA分子－－脱氧核酶 功能：切割RNA、DNA水解酶功能、连接酶功能、多核苷酸激酶、过氧化物酶功能、催化卟啉环金属鳌合物形成 DNA适体（aptamer）：能与有机合物或蛋白质等配体专一、高效结合的DNA片段 与核酶相比，脱氧核酶的特点： 在生理pH下，更稳定 相对分子质量较小，结构相对简单，受空间结构影响较小 剪切RNA的识别靶位点不同 锤头（Hammerhead)结构 二级结构模型 锤头结构的类型 锤头核酶的催化反应机制 发夹（hairpin ）结构 发现于三种不同植物RNA病毒：烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。 三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，分别是sTRSV, sCYMVT, sARMV, 均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。 影响核酶活性的因素 1、pH值：最适pH为7.0-7.5 2、二价金属阳离子：Mg 2+、Mn 2+ 3、抗生素：大多数为抑制效应 4、变性剂 5、温度：在65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有适宜的活性。 特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5’-OH 和2’,3’-环磷酸二酯末端。 不同tRNA的 5’ 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列， RNaseP所识别的是底物的高级结构。 RNaseP底物的二级结构 剪切位点 M1 RNA 5’端完整结构对维持催化活性是必需的。 五、核酶技术面临的问题 1、提高催化效率 2、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 3、使核酶在细胞内有调控地高效表达 4、增强核酶在细胞内的稳定性 5、对宿主的损伤问题有待进一步考察 1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子 通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。 通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来：8-17，10-23。 B A A 5‘ B B A B A PCR PCR 5‘ 5‘ 5‘ Streptavidin Column NaOH cofactor 体外选择技术 筛选具有自我裂解功能的DNA分子 DNA分子库 10-23型脱氧核酶作用机理 R Y R RNA substrate 切割点 R=A or G Y=C or U deoxyribozyme 5? 3? 2、脱氧核酶催化特征 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性：RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性） UCUAAA IVS GUAA Pre-rRNA