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有关PCR技术相关问题的解释 交大附中 冀朝辉 一、反应体系 模板 耐热的DNA聚合酶 dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP 引物 缓冲液 Mg2+ ㈠ 模板 包括：基因组DNA 、质粒DNA、线粒体DNA 、mRNA等 mRNA作为模板时，须先将mRNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为模板 模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 102～105拷贝(100?l体系) ㈡ 引物 设计引物的原则： 两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板的两条链序列互补 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 长度为18-25个核苷酸 两条引物之间避免形成引物二聚体 引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 引物二聚体 同一引物或两个引物间彼此碱基互补配对，形成引物二聚体。 5′-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3′ |||||||||| 3′-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5′ ㈢ 脱氧核苷三磷酸（dNTP） dATP、dCTP、dGTP和dTTP 浓度越高，则酶促反应速度越快，但同时也增加了碱基的错误掺入率和实验成本。 ㈣ 耐高温的DNA聚合酶 第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的论文的作者是台湾的年轻科学家--钱嘉韵。 1973年，钱嘉韵到俄亥俄州的辛辛那提大学生物系就读。她的指导老师崔拉（J. Trela)对一种在黄石公园的热泉里发现的嗜热菌(Thermus aquaticus)感到好奇，就让钱及另一位美国学生以该细菌为论文研究的主题。在另一位老师的指导下，钱嘉韵学会了从细胞中分离蛋白质，并成功分离出该细菌耐高温的Taq DNA聚合酶。 DNA聚合酶复制的保真性 Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。 ㈤ 镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。 虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关， 但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。 ㈤ 石蜡油 加石蜡油的目的是防止高温反应时液体挥发。 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 1．变性 此步目的是：使双链模板DNA解离为单链结构。变性温度一般为92～96℃。 2．退火 此步目的是：引物与模板互补成双链。退火温度一般为55℃左右。 (由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。) 3．延伸 此步目的是：在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。延伸温度一般为72℃。 4．循环次数为25～30次，循环次数越多，非特异产物也就越多。 5. 最后72℃延伸3～10分钟（目的是增加产物量即将未合成完毕的DNA片段合成完毕）。 ㈠ 退火 退火是将金属缓慢加热到一定温度，保持足够时间，然后缓慢冷却的一种金属热处理工艺。 淬火是将工件加热保温后，在水、油或其它无机盐、有机水溶液等介质中快速冷却。 退火温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 退火时间一般为30～60秒，足以使引物与模板之间完全结合 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature) 定义：使50%的DNA发生变性时的环境温度。 ㈡ PCR反应曲线 三、PCR产物的电泳鉴定 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 RT-PCR试剂盒组成(100 次使用量) AMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 50 μl Taq polymerase(5U/μl) 50 μl 10X RT-PCR Buffer 500 μl dNTP Mixture(2.5mM) 500 μl MgCl2(25mM) 500 μl RNase inhibitor(40U/μl) 100 μ