第四章基因的鉴定与表达分析.pptVIP

动物基因组印迹杂交(Zoo blot)是基于人类及其他动物在长期进化中普遍存在基因的同源和保守序列的理论设计的。该方法采用同一基因单拷贝的分子探针与各种动物的基因组DNA作Southern印迹杂交筛选，如果杂交表现为阳性，表明所用的探针中可能包含进化过程中的保守序列，即序列间有很高的同源性，该序列可能是外显子或编码表达基因区域，进而分离基因组中的表达序列。 主要步骤： 制备载体→将基因组片段亚克隆至表达载体中→转化到E. coli中扩增→提取重组质粒并转染至COS-7细胞中→提取RNA→合成cDNA→一级PCR扩增、二级PCR扩增某一克隆PCR产物→鉴定所克隆的外显子。 基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，1991年，Parimoos 等首先提出了cDNA选择法。 这是一种以表达为基础的基因分离技术，通过形成异源双链从基因组克隆中识别表达序列的方法。 原理： 把基因组DNA固定在膜上，用总cDNA与之杂交，通过PCR从中回收可与基因组DNA结合的cDNA片段。 优点： 最大优越性在于PCR反应的介入，大大提高了选择的灵敏度，可以检测到一些稀有转录子。 CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发