分子生物学-聚合酶链反应pcr.ppt

PCR扩增过程图示 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 常用于临床检测（定性） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等 凝胶浓度选择 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解 10×TBE缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应为8.0～8.2 临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释） 核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当 载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 核酸电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收 电泳 电泳装置 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 电泳槽 电泳方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子 根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般 200～400 bp 的DNA片段（可配制1.2～1.7%） 电泳方法配制琼脂糖凝胶及倒胶 0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固 向电泳槽中倒入0.5 × TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去） 电泳方法上样与通电 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1 — 5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般 200～400bp 的PCR产物50V电压，电泳20～40min 电泳方法结果观察 紫外仪上观察电泳带及其位置 并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小 聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离 聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N‘一