第三章 酶的分离纯化 to 学生课件.pptVIP

Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂： 极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中， 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 酶的提取 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 3.4 酶的分离方法 离心机种类 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置-高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。 4、层析分离 3.5 酶的组合分离纯化策略 3.6 酶的浓缩、干燥与结晶 第三章 重点内容 1 酶提取、分离纯化基本技术路线 2 酶粗提常用的方法？ 3 常用的酶蛋白分离纯化方法有哪些？ 4 酶蛋白盐析沉淀和有机溶剂沉淀原理？ 5 膜过滤分离的分类和截留物质的种类？ 6 层析分离的分类和分类依据？ 7 离子交换和凝胶层析分离蛋白质的原理？ * * 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取( 粗提) 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 JY92-II D超声波 细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 DY89-I型 电动玻璃匀浆机 3.3 酶的粗提 酶的主要提取方法 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 可与水混溶的有机溶剂 有机溶剂提取 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 PH8～12的水溶液 碱溶液提取 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 PH2～6的水溶液 酸溶液提取 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 0.02～0.5mol/L的盐溶液 盐溶液提取 提取对象 使用的溶剂或溶液 提取方法 盐溶现象：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离 1、沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 等电点沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使