PCR扩增和电泳检测.ppt

PCR的应用 PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。 * 9班 实验13 DNA片段的PCR扩增 1、用PCR技术对DNA进行扩增 2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测 电 泳 观察 PCR反应 实验步骤 DNA在体内复制的条件是什么？ 模板： 酶： 原料、能量： 解旋酶、DNA聚合酶等。 DNA分子的每条链 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 引物： 温和的反应条件 DNA分子的结构 合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸 合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸 dATP dGTP dCTP dTTP 聚合反应机理： DNA聚合酶 不同细胞的细胞周期 不同生物细胞 需要的时间 细 菌 一般是20~30分钟 蚕豆根尖细胞 17.3小时 小鼠十二指肠细胞 15.3小时 人的肝细胞 22小时 人的宫颈癌细胞 22.5小时 PCR技术可在几小时内， 将特定核酸序列扩增百万倍! PCR的概念 PCR （ Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。 PCR的反应体系 DNA模板 原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ； 酶： Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到） 引物：（单链DNA片段） Mg2+（维持酶活性所必需） PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶 PCR技术原理 变 性 退火 延伸 PCR三步曲 预变性 保温 变 性 90~95℃ 延伸 70~75℃ 退火 40~60℃ PCR仪 用于PCR的预混液（ 500?L 体系）： ddH2O 310 ?L 10×butter 50 ?L MgCl2 40 ?L dNTP混合液 20?L 引物1 25?L 引物2 25?L 模板DNA 25?L Taq DNA聚合酶 5?L 标记一个微量离心管，用取样器取20 ?L 的预混液加入到该管中。 反应试剂 用量 PCR SuperMix 10μL 引物Ⅰ（浓度10μM） 1μL 引物Ⅱ（浓度10μM） 1μL 模板DNA 5μL ddH2O 3μL 总体积 20μL 微量可调移液器（一档吸、二档排） PCR反应参数： 　　 　　 变性 94 ℃ 30 s 退火 52 ℃ 30 s 延伸 72 ℃ 60 s 预变性 94 ℃ 300 s 保温 72 ℃ 600 s 循环次数 35 1、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。 2、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳基本原理 制胶 使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。 混样 2μL载样缓冲液、 2μL 核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。 点样 将上步混好的样10 μL加到凝胶孔中。 电泳 90V电压下电泳10~20min。 琼脂糖凝胶电泳的过程 将凝胶倒入制胶器的槽中 （60oC） 将琼脂糖加入电泳缓冲液, 在微波炉中加热溶解至透明。 制 胶 将梳子从制胶槽中拔出 取出凝胶板放入电泳槽中 向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶 琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用 1、增加电导率； 2、维持电泳过程中的合适的pH。 吸取PCR反应产物10μL。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物