盘羊肺炎支原体感染的PCR检测.pdfVIP

基 础 科 学 中国畜牧兽医文摘 2017年 33卷 第2期 盘羊肺炎支原体感染的PCR检测 1 2 1 张 平 张俊波 贺志昊 （1.毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节 551700； 2.铜仁学院，贵州铜仁 554300） [摘　要] 目的：建立盘羊肺炎支原体（MO）感染的聚合酶链式反应（PCR）检测方法，为盘羊肺炎支原体感染的检测提供参考依 据；方法：对所选取的盘羊进行肺炎衣原体菌种的培养与检测；结果：研究成功分离出MO标准株Y98、MO141分离株、丝状支原体山羊 亚种（MMC）和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的DNA；结论：本次研究方案的成功建立，能够快速检测出盘羊支原体感染的情况，进而 为治疗和疾病预防及时开展提供了科学的依据。 [关键词] 盘羊 肺炎支原体 PCR 羊支原体肺炎是一种由支原体感染所引发的具有高度接触性 2.1　PCR反应条件及敏感性 的传染性疾病，病程可持续数月甚至是数年之久，对养羊业造成 由于不同的退火稳定所扩增出的片段两对有所不同，因此应 了极大的危害。盘羊作为我国野生动物保护的一个重要物种，近 选择最亮的片段所有本次研究最合适的退火稳定为56℃。而Taq 年来有报道发现盘羊陆续出现羊支原体肺炎感染后症状[1] ，为快 DNA聚合酶的浓度应为0.3u/μl。PCR检测敏感性为0.4075 ng。 速诊断出相应病原体，本次研究对近年来常用的PCR检查方法进 2.2 PCR特异性试验 行对比，为疾病快速诊断提供参考。 本次研究层高分离提取出MO标准株Y98、MO141分离株、鼻 1　材料与方法 拭子、丝状支原体山羊亚种和大肠杆菌、金黄色葡萄球的DNA。 1.1　送检材料 通过应用所建立的方法对各标本DNA进行PCR扩增，近在Y98、 本次研究选取某地送检的1岁左右盘羊2只，两只均为雄性盘 MO141分离株和鼻拭子三组标本中出现406bp特异性片段，其余标 羊，送检时羊体明显消瘦，并伴有气喘、咳嗽等症状。 本及阴性对照标本中均未检测到与阳性条目类似的条带，重复试 1.2　菌种与设备 验时结果相同。 本次研究中所用绵羊肺炎支原体标准株（Y98）为中国兽药 2.3　样本检测 监察所所提供，其他菌种由本市兽医学实验室提供。培养基为改 对25份盘羊鼻拭子标本应用PCR检测法见相关检测，其中 良Hayflick培养基1%HLH47.5ml，牛肉汤30ml、猪血清共计20ml， 阳性7例，阳性率为28%。2例送检样本盘羊鼻咽黏膜冲洗液检测 酵母浸出液为1ml、5%醋酸铊为0.5ml，青霉素为200u/ml。 阳性2例，阳性率为100%。采用支原体分离培养法对全部27份样 研究所用MO间接血凝抗体检测试剂盒为美国ADL公司所生 本进行培养，其阳性检出率为14.81%，采用简洁血凝抗体检测 产，其他相关试剂及工具酶均来自上海生工生物工程有限公司。 试剂盒对27份样本进行检验，共计检出阳性样本7份，阳性率为 1.3　引物合成及DNA合成 25.93%。 参考标准MO168rDNA基因序列，应用Primer5.0设计MO特异 3　讨论 性引物1对，引物由上海生工生物工程有限公司进行合成。DNA提 目前临床中对传染疾病进行确诊时，多采用病原菌分离和体 取时，取相应菌种、颜色变黄的支原体培养液1.5ml，离心30min 外培养法进行鉴定，但实践证实，由于支原体生长对于培养基、 （12000r/min）后，收集沉淀物，应用PBS洗涤重悬后，重复洗 环境、血清浓度