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第四章 目的基因的获取 第四章 目的基因的获取 目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 第一节 基因组DNA片断化 第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。 酶切 1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切 点。目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene 二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。 1）4bp 的内切酶 平均每44 （256 ）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI 、Sau3A。 2 ）6bp的内切酶 平均每46 （4096 ）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I） 2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用于DNA ，可使其断 裂成约300bp 的随机片断。 （2 ）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片断。 第二节化学合成目的基因 1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法。 1. 磷酸二酯法 （1）原理 ①保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ②带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③用酸或碱的脱保护 （2 ）合成过程 下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。 2. 磷酸三酯法 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。 合成的二核苷酸连接处有三个酯键！ 固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’- OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。 15 固相磷酸三酯合成过程 C 固相 固相 固相支持物 支持物 支持物 结果是全保护的DNA ：5’ DMT, 3’固相支 持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护 二、化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp 以内。 1. 互补连接法 （1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补