蔗糖糜敫与的分离提纯及酶促.pptVIP

蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验 ; 内容提示 ; 一、目的要求 ; 二、实验原理;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;4、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理： 1）凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物（如双缩脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物； 2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物； 3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试???）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比； 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。;5、有机溶剂分级沉淀的原理： 有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是： 1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分子上不同 电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降； 2）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜，使蛋白质的 溶解度下降。 6、离子交换柱层析的原理： 是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：;1）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 的吸附容量大； 2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对 Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； 3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。 本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。 ; 三、实验流程;4、乙醇分级和透析（制E2） ①离心得E1（无细胞抽提液） 取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度 ② 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度） ③ 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度） ④ 透析（过夜） ;5、柱层析的准备工作 ①组装层析装置;6、 柱层析（制E3） 周五下1：00开始 ① 离心（得E2 ） 取样、 测酶E2活力及蛋白质浓度 ② 上样 ③ 洗柱（用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上） ④ 洗脱 ⑤ 合并酶活力峰,得E3 ⑥ 保存成品E3 测酶E3活力及蛋白质浓度 ; 成品E3 计算出E3浓度 周六（全天）上午8：00开始 (1).蔗糖酶米氏常数的测定 (2).用正交法测定几种因素 对蔗糖酶 活力的影响 ;四、操作步骤及注意事项 ; 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作; 2、Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作 ①取7支试管（干燥）按下表