葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得.pdf

葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明 Sephadex G 型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25 羟丙化 后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组 成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利 用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是 我们实验室常用的原因之一。 Sephadex LH-20 适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机 溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有 效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。 因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg 样品/ml 凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效 果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大； 差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为 5－7％的床体积，我们建议初次 上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也 与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度 依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可 以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通 常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸 附。 LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程 中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可 能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否 则要重新装柱），动态用一倍柱体积的 60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙 醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为 止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱 高.如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。 1. 葡聚糖凝胶 LH-20 的原理。 葡聚糖凝胶 LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主， 兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子 的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。 如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20 对化合物还起反相分配的 作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留 强，后出柱。 如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 2. 葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂。 葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。 用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐 渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用 50％氯仿－－甲醇，逐渐增 加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积 的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进 行过滤！否则把Sephadex LH-20 堵塞，就必须将Sephadex LH-20 的柱头 部分弃去，造成不必要的浪费）。 如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少 体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 4. 葡聚糖凝胶 LH-20的步骤。 （1） 选择条件： 梯度洗脱在葡聚糖凝胶 LH-20 使用中并不象在正相柱层析中那么 重要。首先你的样品须要能溶解