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第五讲 ATP生物发光检测技术 自然界有很多发光生物体 真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们 最熟悉的萤火虫 海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中 游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光” 现象。这往往是大群甲藻——一种单细胞浮 游生物——受到机械干扰后留下的道道光痕 它们几乎对任一种刺激，如海水中化学成份 的波动、压力突变、超声波和激光刺激等 等，都会有闪光反应, 大多海洋生物都靠荧光 素——荧光素酶系统发光 . 不同的荧光素——荧光素酶反应产生不同的 光 发光生物 有许多微小甲壳动物和腔肠动物，在 被惊动时会发出闪光。有一些动物虽 然自己不闪光，但把荧光素和荧光素 酶分泌入水中，让它们相互作用，产 生光雾，掩护自己逃走。 但后来在好多鱼类、鱿鱼类和甲壳类 中，也都找到了这种腔肠动物型的荧 光素。 多年前，科学家已经将生物萤光应用 到生命科学领域。与化学荧光 （fluorescence ）相比，生物萤光 （bioluminescence）更灵敏、更 可信、效果更好。 一 ATP生物发光法检测原理 ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Lu 　ciferase）以荧光素（Luciferin）、 三磷酸腺苷（ATP ）和O2为底物，在Mg2＋ 存在时，能将化学能转化为光能。 ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又 是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素 酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范 围内，其浓度与发光强度呈线性关系。 检测原理 各生长期的微生物均有较恒定水平的ATP含 量，微生物死亡后，ATP将很快被分解掉, 因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测 出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌 量，整个过程仅为几分钟。 优点: 由于生物发光法无需培养微生物过 程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可 得到检测结果，具有其他微生物检测方法无 可比拟的优势，是目前检测微生物最快的方 法之一。 AT P 生物发光法是利用ATP与虫荧光素一虫荧光素酶反应， 产生光子，再用荧光照度计检测发光值，从而得到ATP的量. 海肾荧光素酶海肾荧光素酶(Renilla luciferase)催化的发光反应， 具有很好的浓度线性范围，酶的检测灵敏度达到10-18 mol。 二、ATP生物发光法检测过程 ●ATP生物发光法检测微生物，需要先将微 生物体内的ATP提取出来，测量其发光值， ●对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP 的浓度，最后转化为微生物的浓度。 1、试剂与仪器 主要试剂： 荧光素/荧光素酶试剂 标准ATP试剂 缓冲液 ATP提取剂 主要仪器： TD-20/20荧光光度计 抽滤器及真空泵 pH计 2、ATP的提取 1)在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生 物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生 物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为 ATP生物发光法测定生物量的重要步骤之一。 2)提取方法:TCA(三氯醋酸)法和加热煮沸法提 取ATP 。 3、ATP的检测 1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品 的相对发光值. 2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的 ATP含量, ATP含量可以转化为微生物的浓度. 3)测量荧光所用的仪器: TD-20/20荧光光度计 。 位 单 光 对 相 三、ATP生物发光法的食品应用研究 1 食品微生物检测:与传统微生物检测方法相比，ATP生 物发光法具有简便、灵敏、快速等优点，小型化的测试仪器便 于随身携带，非常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施，从而尽可能避免产品 和资金的浪费。 2 可以用于食品、饮品及空气卫生检测中细菌总数的现场测定。 用于卫生