色谱根基知识 HPLC.ppt

色谱基础知识 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相： 静止不动的一相，色谱柱 色谱优点 同时分析 分离性能好 灵敏度高（ppm-ppb 微克-纳克） 进样量小 （1-100μL） 色谱分类 以流动相状态为标准划分类型。用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法Gaschromatography GC. 用液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法 Liquid chromatography LC. HPLC VS GC 液相色谱： 适用于高沸点 大分子 强极性 热稳定性差的化合物的分析，流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱： 适用于沸点低，热稳定性好的中,小化合物的分析。流动相只起到运载样品分子的作用 HPLC VS GC 高效液相色谱法采用高压输液泵输送流动相及特殊规格填料固定相等，分离效能高，应用范围广,如氨基酸 蛋白质 生物碱 维生素 有机酸 农药，都可用高效液相色谱法进行分析 气相色谱法虽然也具有快速 分离效率高 用样少等优点，但它要求样品必须能够汽化，从而受到样品的挥发性限制。 液相色谱按两相极性不同分为: 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序 正相色谱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。适用于不溶于水/有机混合物的亲脂类样品 使用的流动相（极性相对比固定相低，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 色谱柱基本性能参数 硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 尺寸 填料床的长度和内径 粒径 平均颗粒直径，通常3-10μm 孔径 颗粒的孔或者腔的平均尺寸，范围80-100A 封尾 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 色谱中常用的术语 色谱图 组分从色谱柱流出并通过检测器时所产生的响应信号的微分曲线 基线 正常情况下，仅有流动相通过检测线时所产生的响应信号的曲线。 峰高（h） 峰最大值到峰底的距离 峰宽（W） 峰两侧拐点处所做切线与峰底相交两点间的距离。峰高一半处的峰宽叫半高峰宽（W ?h） 死时间（t0）实际上就是流动相流经色谱柱所需要的时间 保留时间（tR）从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间,称为此组分的保留时间 调整保留时间 (tR)扣除死时间后的保留时间 tR= tR-t0 容量因子（k） k= tR ／t0 k值越大，组分出柱越慢，保留时间越长 柱效 柱效简而言之就是色谱柱对色谱中物质分离能力的大小。柱效越高，分离效果越好，峰形越好。色谱柱的柱效和填料、柱长、柱内径均有关系，一般来说，填料越细密、柱长径比越大，柱效越高。柱校的衡量用理论塔板数来表示。 理论塔板数（n） n=5.54×(tR/ W ?h)2 n=16×(tR/W)2 理论塔板高度（H） H= L/n L:色谱柱长 分离度（R) R= 2（tR2-tR1）/（W1+W2) 相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰宽总和一半的比值。 R1时,两峰有部分重叠 R=1时,分离程度可达98% R=1.5时,分离程度达99.7%，可认为两组分完全分离 增加柱长可以提高分离度，但延长了分析时间 拖尾因子（T） T= W0.05/ 2d0.05 W0.05 W0.05 5%峰高处峰宽 D0.05 5%峰高处的前半峰宽 中国药典》规定T应为0.95～1.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。 色谱图的峰位置用于定性，色谱峰的峰高和峰面积用于定量，峰位置和峰宽用于色谱柱分离性能的评价和色谱条件的优劣。 流动相 流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 HPLC用水可以通过以下几个方面来得到： 1 专门的纯水机或超纯水机； 2 去离子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用类似家用的纯水机； 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 6 其它途径； 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 溶剂前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或