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小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离 T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg） B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。 不同细胞密度不同 细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。 * * 基本概念 所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。 包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。 免疫细胞分离方法： 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、MACS 根据细胞理化性质： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感 流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。 ?? 流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。 将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合，通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细胞/h)的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达90%～99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。 FACS 荧光激活细胞分离仪分离法 流式细胞分析仪 磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 MACS 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。 　 免疫磁珠法细胞分选过程 免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置 全自动细胞分选系统 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法： 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。 ??? 密度梯度离心法 人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞密度不同 用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 　 密度梯度离心法 离心后 血浆 单个核细胞（PBMC） 粒细胞 红细胞 实验五 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离 胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小，胸腺体积相对越大。 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形态，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻入脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。 解剖图 取脾脏 实验步骤： （一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶液中浸泡3~5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪及筋膜组织。 （二）制备单个核细胞悬液： 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指