9.受体放射分析.ppt

目前，用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。氚标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件（单碘标记物），仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。测量操作简单，所以125I-配基也大量采用。需要注意的是自行标记125I-配基要解决两个难题： ①要确定标记物的比活度，如果比活度不确切，最后所得的受体结合位点数不确切。②标记配基的纯化：多肽的碘标化合物往往产生一碘（monoiodinated）和二碘（iodinated）标记物。这些标记物对受体的亲和力有可能是不同的。 125I核素在存放过程中要衰变，因此125I配基应该注意比活度的衰变校正，而且要有正确的校正方法。 标记配基的存放问题：标记配基在存放过程中，由于受到核素的衰变，放射性的损伤等原因，其化学和生物学性质必然会产生某些变化。为减轻损伤，氚标记物，一般采用原包装的溶剂作适当稀释后，在原推荐的温度下保存。 125I标记物常用1％BSA的缓冲液适当稀释后分装，在-20℃中存放。 （二）放射性配基的质量鉴定 选定好某一种放射性配基后，在具体使用前还应对其质量作适当的鉴定，以保证受体结合分析结果的准确性。例如，一般是假定和推测所用的标记配基与原型配基具有相同的生物活性，但具体使用时，应认真进行评价。这一点常常是很多研究报告的结果对同一受体出现很大差别的重要原因。 1、放射化学纯度 放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜产品外存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在 95 ％以上。 2、结合活性鉴定 受体结合分析中，放射性配基的活性特别重要，特别是生物活性。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力。即测定其最大结合活性。现介绍JC Kermode提出的一种方法如下：①以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂（饱和结合实验）进行反应，测定结合百分率；②以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线；③延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性％。（如图） 3、比活度 受体结合分析最后的结果计算时离不开准确的比活度数据。必要时也可用放射受体自身置换法测定比活度。这一方法若使用得当，能较准确测定比活度，而且也反映标记配基的受体结合活性。 二、受体标本的制备 在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。 （－）组织切片 冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50μm。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化法）。 （二）游离的完整细胞悬液 完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。完整细胞的优点是在研究受体结合特性同时，能进行生物效应的测定。使用完整细胞的优点如下： 1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如G蛋白）也保存完好。 2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。 3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。 但完整细胞的受体分析较难控制分析条件。操作过程可能导致细胞表面生理活性的改变，因此结果有时不够稳定。另外，若细胞上某种受体的含量低，作分析时需加入大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。完整细胞来源分三种：①从组织分离出游离细胞；②血细胞；③培养细胞。一般都需采用台盼蓝等检查细胞活性。 （三）膜制剂（membranous preparation） 绝大多数受体结合分析使用膜制剂。使用膜制剂可以减少非特异性结合率。而且，在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制剂通常也保存有受体-效应器（包括GTP结合蛋白等）结合系统。但受体功能的其他方面则失去了。另外，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，而不是细胞内其他组份。所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。 细胞膜和细胞浆受体的