李淑娟-六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究西北大学硕士学位答辩20076.pptVIP

西北大学硕士研究生论文答辩 小结 以6×His为半抗原，KLH为载体蛋白，碳二亚胺(EDC)为偶联剂合成了完全抗原6×His-KLH 。 以6×His-KLH免疫动物得到抗6×His的抗体，结果表明制备的抗6×His抗体可用于纯化六聚组氨酸融合蛋白，但还需进一步摸索和完善。 通过饱和硫酸铵沉淀抗血清后，测效价大于20000。 以金磁微粒为载体固定KLH，尝试通过免疫亲和法去除多克隆抗体中抗载体蛋白KLH的抗体，得到了纯度较高的针对6×His的抗体，为下一步系统研究6×His融合蛋白纯化奠定了基础 。 第三部分 西北大学硕士研究生论文答辩 致谢 本论文是在我的导师崔亚丽教授的关怀和指导下完成的，首先我要向她表示最真诚的感谢。崔老师严谨的治学态度、一丝不苟的科研精神、对学生既严格要求又给予无微不至的关怀，这些都给我树立了一个优秀的榜样。 感谢陕西北美基因股份有限公司及陈超教授对我实验的支持与帮助，陈老师渊博的知识面，开阔新颖的思维方式，对问题一针见血的分析，让我在求学和科研过程中受益匪浅。 感谢陕西师范大学的胡道道教授和孙永亮，第四军医大学的金伯泉教授和庄然博士在实验中给予的帮助。 感谢陕西北美基因股份有限公司朱娟莉老师、李铮老师、彭明丽博士在实验中给予的帮助。 感谢我的同学褚巍、常玉巧、肖娜、李芳、曹树辉、李恒砚、于按、唐一通、付强、姚敏杰及师弟师妹刘蓓、杨柳等在生活、学习、实验中对我的关心和帮助，我会永远铭记和你们一起度过的快乐时光。 感谢北美基因有限公司所有共事的员工和同学，谢谢你们的帮助和关心。 最后，我要感谢我的家人这么多年来对我默默的关怀、支持和帮助，你们的爱我永远回报不尽！ 各位老师和同学，大家好！ 我的答辩题目是六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究，指导老师崔亚丽教授。 答辩内容分为三部分，分别是融合标签技术简介，金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白纯化的研究， 抗六 聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性微粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化。 第一部分，融合标签技术简介。融合标签技术是利用利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3′端或5′端融合某种 标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与固定化配体结合结合 而进行纯化。融合标签包括两大类：大的蛋白质分子和小的多肽片段，大的蛋白质分子有GST—谷胱甘肽巯基巯基转移 酶、葡萄球菌蛋白A — SPA、绿色荧光蛋白— GFP等，小的多肽片段有六聚组氨酸— 6×His、 流感病毒血凝素的一个 表位— HA、 c-myc蛋白的一个表位—c-myc 。 融合标签技术主要用于蛋白质纯化、固定和检测，他们都是利用融合标签和固相配体的相互作用对蛋白进行纯化、固 定和检测。常用的蛋白纯化标签有六聚组氨酸、谷胱甘肽巯基巯基转移酶、表位标签。 六聚组氨酸标签和其他标签相比有如下优势： 6×His较小，所以基本上不影响蛋白的结构和功能。 对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力。 与金属离子的结合不受变性剂（尿素、胍）的影响。 带有6×His标签的融合蛋白与金属离子结合后具有温和多样的洗脱条件。 六聚组氨酸融合蛋白通常用金属螯合亲和层析法和免疫亲和法来纯化，本论文就是通过这两种方法对六聚组氨酸 融合蛋白