第二章第五节2蛋白质工程.pptVIP

蛋白质工程 蛋白质工程 蛋白质工程： 是以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造。 目的： 是为构造并生产性能比现有蛋白质更加符合人类需要的蛋白质新品种提供科学依据和技术途径，同时，为分子生物学的基础理论研究提供强有力的新手段。 蛋白质的结构 1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang首次提出蛋白质三级结构的概念： 一级结构：指多肽链中氨基酸的一定的顺序，靠共价键维持多肽链的连接，而不涉及其空间排列。 二级结构：指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。 三级结构：指整个肽链的折叠情况，包括侧链的排列，也就是蛋白质分子的空间结构或三维结构。 1958年英国晶体学家Bernal提出四级结构概念： 四级结构：指蛋白质亚基的排列。 蛋白质的超二级结构和结构域 超二级结构：1973年Rossman提出，指二级结构的组合物。 结构域：由Porter提出，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。 蛋白质工程就是对自然界存在的蛋白质加以改造，改造的目的是得到性能更符合人类要求的非天然蛋白质，以用于工业、农业、医药卫生等各领域。 蛋白质改造的方法： 通过改造它们的基因，再用基因工程的方法由工程菌种来生产新的蛋白质。 与药物设计的关系： 近年来随着药物设计发展的需要，基于生物大分子结构知识的药物设计已成为药物发展中的重要领域，由于这种设计途径在很大程度上与蛋白质工程有着深刻和广泛的联系，因此往往在学术上与蛋白质工程一起讨论。 三类专家： ①蛋白质空间结构测定的专家； ②蛋白质分子设计的专家； ③基因工程的专家。 空间结构测定的专家： 主要应用X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。 分子设计专家： 在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，主要通过理论的方法，提出蛋白质改性的设计方案，这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同，这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化，从而能赋予新蛋白质什么样的特性。 当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具，采用基于物理学原理的各种模拟方法和基于蛋白质的改性分子结构知识的模型构建方法，或兼用这两类方法。 基因工程专家： 在得到了新的蛋白质的改性设计方案之后，就用一套分子生物学的技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白质的产物，最后通过分离、纯化，提取出足够纯的新蛋白质以研究它的性质。 蛋白质工程的这一程序不是一次就能实现的，往往要经过多次的循环，不断改进设计方案才能发现一个理想的新改性蛋白。 当前蛋白质工程研究的热点： 一方面是对具有明显生物学功能的天然蛋白质分子； 另一方面是基于生物大分子结构知识的药物设计。 蛋白质人为进化 定向进化 定向进化 原理：在待进化基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化蛋白质, 从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则：“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 体外定点突变 在已知的DNA的序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变蛋白质结构中的个别氨基酸的序列。 随机突变 易错PCR DNA shuffling 高突变菌株 交错延伸 体外随机引发重组 杂合酶 易错PCR 易错PCR：是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。 原理：通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP 的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP 来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR 缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。 DNA shuffling DNA shuffling：即将DNA拆散后重排。 它是模仿自然进化的一种DNA 体外随机突变方法。 这种方法不仅可以对一种基因人为进化，而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组，共同进化出一种新的蛋白质。 DNA shuffling基本过程包括四个步骤： 1、目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因； 2、DNaseI酶切：将基因随机切割成约