HIV假病毒的制备及感染性检测.docVIP

假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞 　 来源: 　日期：2011-4-11　(共有 0 条评论)??我要评论 我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。 (一)材料 1．质粒 pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。 pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。 两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。 2．细胞系和培养基 HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。 3．Ca3(P04)2转染试剂 2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。 4．感染试剂和荧光素酶检测试剂 Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。 (二)方??? 法 1．假病毒粒子的包装 1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10mlDMEM／10％FBS 2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中； 3)转染24h后换培养基； 4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀； 5)分装成lml小管，一80保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。 2．假病毒感染HOS细胞或U87细胞 1)感染前一天，传HOS．CD4细胞或U87．CD4细胞(表达共受体分子)至24孔板，5×10^3个／孔／1ml DMEM／10％FBS(不加嘌呤霉素)。 2)把培养基换成含假病毒(10ng p24)的0．5ml的DMEM／10％FBS，可加入终浓度为8ug／ml的Polybrene来增强病毒感染力，也可不加。同时，加入不同浓度梯度的药物。 3)5~18h后更换含不同浓度梯度药物的新鲜培养基。 4)转染后3天，收集细胞：弃培养基后，用lml PBS洗涤细胞，重悬细胞后，100g离心5min细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min。 5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的EC50值。 3．假病毒感染CEM细胞 1)感染前一天，传CEM细胞，培养基为RPMI-1640／10%FBS； 2)调CEM细胞数为3×10^5／ml，加细胞300u1/孔至24孔板，同时加入假病毒(10ng p24)和不同浓度梯度的药物； 3)3～5h后加入含不同浓度梯度的药物的0．5ml培养基； 4)转染后3天，收集细胞：用1．5ml的离心管收细胞后，100g离心5rain细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min； 5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的ECso值。 假病毒也能感染一些原代细胞，如PBMC，但检测时间为5～10天。 为获得较高的荧光素酶读值，高效的转染是关键。如果包装的假病毒滴度比较低(p24抗原的浓度小于50~100ng／ml时)，假病毒感染293细胞后，荧光素酶读值会非常低。此外，假病毒的宿主细胞293细胞的状态非常重要，因为293细胞是非常灵敏的。如果感染假病毒前，293细胞贴壁性不好或293细胞形态不饱满，感染效率也是很低的，荧光素酶读值也会很低，可以考虑用293T细胞来代替293细胞。 荧光素酶的底物产生的荧光是非常强的，但产生的荧光也很短暂，半衰期为5min左右，Packard公司提供的荧光素酶试剂盒产生的荧光半衰期要长一些，为lh左右，如果检测时间需要比较长的话，可用Packard公司产品。 假病毒从一80融化后，应立即使用；即便马上再次冻融，活性