植物转基因原理与技术.doc

植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术　　转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。　　根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。　　　　　　　　　　　　　　　　　　外植体）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　愈伤组织　　　　　 瞬时表达外源基因　　　　 植物受体细胞　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 生殖细胞　　　　　稳定表达　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 获得抗性生根转基因苗　　　转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等） 技　 　　就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。　　一 载体转化技术　　载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激素和冠瘿碱合成酶的基因替换为外源基因，从而携带外源基因整合到植物基因组中去。Ti质粒载体系统主要有共整合载体系统和双元载体系统。共整合载体系统是利用含T-DNA的大肠杆菌小质粒插入目的基因后转到含天然Ti质粒的农杆菌中进行同源重组达到将目的基因插到Ti质粒中。双元载体系统是目的基因克隆于含T-DNA的大肠杆菌小质粒中，转移所需的Vir基因由缺失T-DNA的Ti质粒反式提供。农杆菌对植物的感染有以下几种方法：1活体接种法 2共培养法　农杆菌和原生质体，悬浮细胞和愈伤组织共培养转化。3叶盘法 　　Ri 质粒可以诱导毛状根，毛状根经过激素处理可以分化成可育得成体植株。但由于对Ri 质粒了解还不多，现在利用Ri 植物病毒载体系统是将外源基因插到病毒基因组中，通过病毒浸染而将外源基因导入到植物细胞中。目前正在研究发展的植物病毒载体有三种：单链RNA 植物病毒载体系统，单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA 植物病毒载体系统。　　不用载体，采用物理或化学方法直接将外源基因导入到受体系统，包括化学物质诱导法，电激法，基因枪法等。　　1．化学诱导法 DNA直接导入的方法。初期是从促进原生质体融合的方法衍生出来。目前主要有PEG介导和脂质体介导两种方法。PEG为细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，从而有利于DNA分子的进入。脂质体法使用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过原生质体的吞噬或融合作用把内含的DNA分子转入受体细胞的方法。这两种方法转化率较低，这与原生质体