网织红细胞样品的制备及分析.doc

网织红细胞样品的制备及分析 (一)染色原理 网织红细胞是一种未完全成熟红细胞。在细胞成熟过程中，其胞质中的RNA含量逐渐被血红蛋白所取代，因此，检测红细胞中RNA的含量多少，就代表了红细胞的成熟程度。从而成为检测网织红细胞的重要方法。网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达0.20或更高。急性失血后5～10d，网织红细胞达高峰。2周后恢复正常。典型再生障碍性贫血病例，网织红细胞百分比常为0.005。网织红细胞数低于5×109/L为诊断再生障碍性贫血的标准之一。网织红细胞升高表示骨髓红细胞增生活跃，多见于各种急慢性失血、溶血和治疗有效的各类增生性贫血，如缺铁性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞性贫血等，是贫血治疗中非常有价值的监测指标。网织红细胞减低见于各种骨髓增生能力低下的疾病，尤多见于重型再生障碍性贫血等。 (二)样品制备 (1)抽取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/LEDTA溶液中; (2)用微量取液器取50μlEDTA抗凝血，置于另一离心管中，加入Good缓冲液5.0ml，以1000r/min离心5min，连续洗3次; (3)将沉淀细胞加入1.0ml枸椽酸钠缓冲液，轻轻振荡悬浮; (4)将悬浮液缓慢注入盛有4ml0.1%戊二醛缓冲液中固定15min; (5)上FCM之前，用PBS洗去固定剂，加入0.5ml0.01%的派若宁Y工作液;染色30min离心沉淀物，去染液，然后1500r/min离心5min; (6)用PBS洗1次，以1500r/min离心5min，去上清液，再用PBS将细胞悬浮，上机检测。 (三)检测分析 运用对数放大的前向与侧向散射光信号来区分红细胞与血小板。要采集足够数量的细胞进行分析，一般网织红细胞低于总红细胞的0.5%，最少要采集50000个细胞进行分析以减小CV值。建立FSC/SSC双参数直方图，运用对数放大后可设“门”圈定红细胞。对于检测样本或对照，在单参数直方图中分析红细胞门中细胞。注意在分析直方图上，主要细胞群体可能会偏移，这可能是由于成熟红细胞过度染色造成的。检查强荧光表达区域并去除这些强阳性细胞，这些细胞是标本中的有核红细胞着色后形成的。在成熟红细胞与有核红细胞之间设立适当的线性“门”(高于成熟红细胞低于有核红细胞)统计网织红细胞的比例。如有必要，设立不同的线性“门”来统计不同成熟度的网织红细胞的百分比。根据荧光强度，还可将网织红细胞分成低荧光强度网织红细胞(lowfluorescentreticulocyte，LFR)、中荧光强度网织红细胞(middlefluorescentreticulocyte，MFR)和高荧光强度网织红细胞(highfluorescentreticulocyte，HFR)部分。幼稚网织红细胞显示最强的荧光，反之，成熟红细胞极少或没有荧光。 (四)临床应用 1.骨髓移植评估骨髓移植后的红细胞生成情况，HFR计数提供了早期测量依据，同时也比监测单核细胞水平更为精确和实际。 2.贫血可将网织红细计数及其分类作为鉴别诊断的初筛指标。 3.地中海贫血地中海贫血以无效造血和红细胞寿命缩短为特点，网织红细胞计数与HGB水平变化相反，轻度贫血或非贫血患者，网织红细胞增长可能非常轻微以致手工计数察觉不到，而使用精确的自动计数技术则明显多了。 4骨髓增生异常综合征一般说来，MFR在HFR之前进入循环，暗示红细胞生成规律性恢复的开始。Kuse认为，少量MFR可以作为MDS化疗后粒系恢复的早期指标，且比RET绝对值更敏感。 5.放疗与化疗通过网织红细胞流式法分析可获得骨髓增生，特别是红系增生及放、化疗的细胞毒副作用的信息，在造血反应中(如叶酸和维生素B12)放疗后或化疗后造血恢复中可见网织红细胞短暂迅速的增高。当HGB下降、组织氧化受阻时，EPO生成增多，EPO促使干细胞向原始红细胞分化，也加速网织红细胞释放。因此，EPO增加，HFR也增多，并伴有网织红细胞的增多。化疗后骨髓EPO功能恢复，早期HPR增多比网织红细胞总数恢复早，这种反应时间的不同体现了EPO与HFR之间的密切关系。用外周血网织红细胞计数优于用白细胞计数和血小板计数分析骨髓造血状态。 6.抗贫血药疗效观察网织红细胞可作为疗效观察指标。凡是骨髓增生功能良好的患者，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在1周左右可达到高峰，贫血越严重，网织红细胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。贫血病在抗贫血治疗过程中，如果网织红细胞不见升高，说明该种治疗无效或骨髓造血功能障碍。因此网织红细胞计数是对贫血患者经常随访检查