第四章酶工程制药的工艺和工程化技术1.pptVIP

第四章 酶工程制药的工艺和工程化技术1 4.1固定化技术 第一节 酶的固定化 一、固定化酶的定义 优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，能回收，反复使用； ②生产工艺可连续化、自动化，能在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； ③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ④反应过程能加以严格控制； 二、固定化酶的制备原则 ①维持酶的催化活性及专一性； ②应该有利于生产自动化、连续化； ③应有最小的空间位阻； ④酶与载体必须结合牢固； ⑤应有最大的稳定性； ⑥成本要低，有利于工业使用。 ㈠ 非共价结合法 ㈢ 包埋法 不需要与酶蛋白的氨基酸进行结合反应，通过膜结构的包裹作用进行的酶的固定化。 只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。 四、固定化酶的性质 由于固定化也是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相转移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素，必然对酶的性质产生影响。 ③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻； ④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。 第二节 辅酶的固定化 一、有机辅因子的固定化 二、辅酶的再生 第三节 细胞的固定化 固定化细胞：就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 二、固定化细胞分类、形态特征和生理状态 固定化细胞按其细胞类型分类，有固定化微生物、植物和动物细胞三大类； 三、固定化细胞的制备 ①化学法（共价交联法）：涉及酶或细胞的化学修饰。细胞间、细胞和载体间的键不易被底物或盐所破坏，所以操作稳定性高。但这类方法可引起细胞破坏。 四、固定化细胞的性质 固定化基因工程菌和游离工程菌相比较发现，固定化细胞具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、稳定性好等特性。 五、固定化细胞体系的影响因素 1．接种量 2．固定化介质 3．胶粒数量 4．介质浓度 5．营养缺失 6．培养温度及pH 7．溶解氧浓度 第四节 固定化酶与固定化细胞的应用 一、生化及分子生物学基础研究 二、亲和分离系统 三、药物控释载体 四、生物传感器 五、用于临床治疗 二、亲和分离系统 三、药物控释载体 （一）聚合物修饰 （二）凝胶包埋 （三）微球制剂 （四）脂质体 （五）导向药物 四、生物传感器 （一）生物传感器的组成和工作原理 （二）生物传感器中配基的固定化 （三）生物传感器的发展和应用 电化学生物传感器的基本组成敏感元件（分子识别元件）和信号转换器件 应用举例 氨基酰转移酶生产L-氨基酸 (1)氨基酸酰基转移酶的固定化 酶反应器 ㈠ 生物传感器的组成和工作原理 传感器是能将一种被测量的信号（参量）转化为一种可输出信号的装置。生物传感器就是利用生物成分作为感受器的传感器。有感受器、换能器和电子线路三部分组成。 感受器的制备包括两方面的工作，一是选择最佳的载体材料，二是在载体表面固定化亲和配基，这需要对载体表面进行活化预处理，使其表面带上各种需要的活性基团，如羟基、氨基、醛基、巯基等。然后通过化学反应把配基键合到载体表面上，从而才能完成对各种生物分子的检测。 换能器，可以感受知固定化配基与待测物质特异性结合产生的微小变化，并把这种变化转化成其它可以记录的信号，如检测电学变化、密度和质量的变化、热学的变化，并把这些信号发送到放大装置中，输出并记录结果。 ㈡ 生物传感器中配基的固定化 在载体材料的表面固定亲和配基的技术主要包括两类：一是非共价吸附；二是通过化学反应共价交联。不管是哪一种结合方法，目标都是保持亲和配基与待测分子的特异性结合活性。 ㈢ 生物传感器的发展和应用 1．产生一些新的分析检测装置 生物传感器的操作理论已经应用了30余年的时间，只有近几年才取得了突破性进展。这种技术的应用，必将产生一些新的分析检测装置，如葡萄糖检测仪，免疫分析检测早孕，乙肝和尿糖的试纸等。现在已经有人设计出在晶体管芯片上，亲和固定化几十种配基，能在几秒钟之内测定一系列生物化学和医学诊断学的数据，甚至连基因突变和缺失都可以检测。 酶电极 （a）葡萄糖电极 半透膜 酶胶层 感应电极 酶电极示意图 ?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O 葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌 葡萄糖氧化酶 氢醌 醌＋2H＋＋2e－ Pt 铂电极 （b）脲电极 Urea +