兔自身免疫性干眼模型制作及检测.ppt

兔自身免疫性干眼模型 泪腺组织RNA的提取 ： （6）弃掉上清，加入1ml的75%乙醇（提前配置：750uL无水乙醇+250uL DEPC水），倒置上下摇晃几次，4℃ 离心机10000rpm 离心5min。 （7）观察管底，避免枪头碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥10min。 （8）随后将RNA溶于20uL的DEPC水中，置于冰上，混匀后取1μL在NanoDrop ND-100上测RNA浓度，测三次，取其均值，记录标注好并将RNA-保存在80℃冰箱中。 兔自身免疫性干眼模型 泪腺组织RNA逆转录 ： （1）将保存于-80℃的所需的RNA置于冰上待其溶解，根据标注好所测的浓度按照1μgRNA，20μl体系逆转录，计算出不同RNA所加的体积。 （2）先将RNA所在EP管涡旋离心，将标记好的EP管分别加入计算好体积的RNA，Oligo(dT)1μl,DEPC水补到12μl，涡旋离心后置于冰上待用。 （3）用Thermo PCR仪，提前设置好温度时间，待PCR仪机器盖子温度升高后放入样本，65℃ 5min。 （4）取出样本置于冰上，每个样本按顺序加入 5×Reaction buffer 4μl Inhibitor 1μl Transcriptase 1μl 10MmdNTP Mix 2μl （5）涡旋离心混匀后，待PCR仪机器盖子温度升高到40℃后放入各样本，42℃ 60分钟，70℃ 5分钟，待反应结束后即EP管中的为逆转录生成的cDNA，将其逆转录产物cDNA置于冰上，然后用DEPC水稀释10倍，涡旋离心混匀后置于-80℃冰箱保存。 兔自身免疫性干眼模型 实时定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR ： 反应原理:使用美国Applied Biosystems公司的实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪分析应用 Applied Biosystems 7900HT FastReal-time PCR System，SYBR Green 法，使用 Fast SYBR@Green Master Mix。在PCR反应过程中SYBRGreen荧光染料掺入DNA双链后发射荧光信号，而不掺入DNA双链的SYBR荧光染料不会有荧光信号，所以SYBR Green荧光信号与DNA扩增产物的增加一致。双链DNA在变性过程中解开呈单链，没有荧光, 在形成双链DNA的复性和延伸过程中, SYBR Green发出荧光，此阶段PCR仪器釆集荧光信号。利用此信号的变化对PCR扩增反应中扩增产物扩增量的变化进行检测，用循环数对基因定量分析。GAPDH将作为反应内在参照, 用内参对所检测样品所含的DNA进行定量分析的方法。相对定量结果分析采用比较荧光强度达阈值时的循环数(Ct)值法（2-ΔΔCt法），扩增的倍数=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参）实验组-（Ct目的基因-Ct内参）对照组。各指标均重复检测3次，取平均值。本实验通过实时定量PCR检测泪腺组织中Th1、Th17、Treg细胞分化相关细胞因子及转录因子mRNA相对表达量。 Company Logo Company LOGO Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo 兔自身免疫性干眼模型制作及检测 兔自身免疫性干眼模型 概要 通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性干眼模型，对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。 兔自身免疫性干眼模型 实验动物 ： 成年雌性新西兰白兔，体质量2.6～3.5kg。 实验前进行兔子临床眼科检查, 排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，建立正常兔眼的临床检查指标的基线水平。 饲养环境符合医学实验动物环境的要求，动物饲养房温度为 25±2℃，相对湿度 50%～75%，12 小时光照昼夜循环，通风状况好。 兔自身免疫性干眼模型 实验所用的主要仪器、设备及材料 ： 生物超净工作台 CO2恒温细胞培养箱 移液枪 -80℃超低温冰箱 倒置相差显微镜 台式离心机 裂隙灯显微镜摄像系统 离心管、枪头 PCR仪 实时定量PC