蛋白质组学入门问题FAQ.pdfVIP

中国试剂网 3.26.173.26.17 蛋白质组学入门问题FAQ 常见问题——— HPLC 篇 1 ． HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法 样品量不足：解决办法为增加样品量 样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器 检测器衰减太多：调整衰减即可。 检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数 检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。 检测池中有气泡：解决办法为排气。 记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。 流动相流量不合适：调整流速即可。 检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 2 ． 做 HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决? 原因可能有： 　 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； 比例阀失效，更换比例阀即可。 泵密封垫损坏，更换密封垫即可。 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； 系统检漏，找出漏点，密封即可。 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。 3 ．我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么? 柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是 柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。 拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查； 3.26.17 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下 降，再检查。 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， ( 此 时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性 ) 。这时，如果柱压仍不下降， 再检查； 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些 杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进 样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 4 ．液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? 筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。 双向电泳篇 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？ 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条 吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最 好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设 计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻 的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在 空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在 相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。 3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶) ？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会 导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离， 产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。 3.26.17 4. 跑第一