TSA抑制NFκB-p50而减轻缺血性脑损伤_0.docVIP

TSA抑制NFκB/p50而减轻缺血性脑损伤 【摘要】 目的： 研究 曲古菌素A（TSA）对缺血再灌注性脑损伤小鼠的保护作用及其可能的分子学机制。 方法 ：小鼠侧脑室立体定位注射TSA；插线法制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型；神经功能评分进行行为学研究；TTC染色检测脑梗死面积；Western blot测定COX2、iNOS、NFκB/p50的表达。结果：小鼠缺血再灌注损伤脑可出现明显的神经功能缺失，并出现较大面积的梗死灶，TSA能明显改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能，减小脑梗死面积。缺血再灌注损伤脑组织COX2、iNOS炎症蛋白和NFκB亚单位p50蛋白表达增加， 应用 TSA后可显著抑制上述蛋白的表达。结论：TSA可通过抑制炎症反应对脑缺血再灌注损伤小鼠具有脑保护作用，此作用可能由NFκB/p50途径介导。 【关键词】 曲古菌素A 缺血再灌注损伤 NFκB/p50 脑保护 炎症反应 缺血性脑损伤的机制尚未清楚，研究显示炎症反应为缺血性脑损伤的病理机制之一[12]。寻找有效的抑制缺血性脑损伤后炎症反应的方法已成为国内外神经病学界研究热点之一。曲古菌素A（trichostatin A, TSA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACI），可通过对组蛋白的共价修饰从而调控真核生物的基因转录，已广泛应用于肿瘤的 治疗 [34]。最近研究显示，HDACI还具有较强的抑制炎症因子生成作用[56]，但HDACI在缺血性脑损伤中的作用研究很少。本实验就TSA对脑缺血再灌损伤小鼠的保护作用及其机制作一探讨。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 雄性昆明白小鼠27只，体质量18～22 g，10～12周龄，由南京大学医学院附属鼓楼 医院 动物实验中心提供；小鼠分为3组，即假手术（control）组、缺血未治疗（MCAO）组及TSA处理（TSA）组，每组各9只。MCAO组侧脑室注射2 μl PBS，TSA组侧脑室注射2 μl TSA溶液（TSA质量浓度为0.5 mg·ml-1），2 h后，这两组（手术组）制作缺血再灌注模型，即缺血2 h后再灌注24 h。 1.2 仪器与试剂 手术显微镜(carl zEiss opmi pi2co100)；显微手术器械；小鼠固定板；1%戊巴比妥钠； 2,3,5氯化三苯基四氮唑(2,3,5triphenyltetrazolium chloride，TTC)、TSA购于美国Sigma公司；多聚甲醛（上海凌风化学试剂有限公司）；鼠脑立体定位仪（上海奥尔科特生物 科技 有限公司）；BCA Protein Assay Kit（PIERCE公司）；兔抗COX2单抗（Santa Cruz公司）；兔抗iNOS单抗（Santa Cruz公司）；兔抗p50单抗(Santa Cruz公司)；鼠源GAPDH单抗（Santa Cruz公司）；抗兔IgGHRP抗体（Santa Cruz公司）；抗鼠IgGHRP抗体（Santa Cruz公司）；ECL plus Western Blotting Detection System试剂盒（PIERCE公司）。 1.3 侧脑室注射 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。随后俯卧，固定于鼠脑立体定位仪上。0.5%碘伏消毒小鼠头顶部皮肤，而后在鼠脑头皮正中做1 cm长纵行切口，暴露前囟门。以前囟门为坐标，选择向右1 mm、向后0.3 mm为侧脑室注射穿刺点，用微量注射器直接进针3 mm后，向侧脑室内缓慢注射2 μl PBS或TSA溶液（TSA浓度为0.5 mg·ml-1）。5 min后，每隔3 min使微量注射器向外拔出1 mm，以防脑脊液迅速流出。待微量注射器全部拔出后，立刻缝合皮肤，并以碘伏消毒。 1.4 局灶性脑缺血再灌注模型 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(45 mg·kg-1)。颈部略偏右侧切口，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉等，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉距颈总动脉分叉部1～2 mm处剪一小口，插入预先制备好的60尼龙线栓，送至颈总动脉，随之扎紧预留好的丝线，从破口处剪断颈外动脉，松开颈内动脉上的血管夹，并让线栓向颈内方向推送，直到遇到轻微阻力不能再前进为止，此时线段即进入大脑中动脉起始部，测进线深度为1 cm左右。随即松开颈总动脉上的血管夹并缝合皮肤。2 h后，再次麻醉小鼠，抽出栓塞线段至颈外动脉处，遇到阻力即停止。扎紧丝线，剪断血管外多余的丝线。即可实现再灌注。 1.5 神经功能评分 再灌注24 h后，采用Longa 5分法[7]对小鼠的神经功能缺损进行评分。0 分：无神经缺损症状；1 分：左前肢不能完全伸直；2 分：向左旋转；3 分：