河蚌闭壳肌mRNA的体外翻译和产物分析.pdf

维普资讯 第 21卷 第 1期 生物化学与生物物理学报 、r01．21．No．1 s。年 1月 ACTA Bl0eⅢ 缸 0A 成 B10PⅡY8IaA SI IeA J翘 ．1980 河蚌 闭壳肌 mRNA的体外翻译 和产物分析 谆苦颖 龚祖埙 曹天钦 (中国科学院上诲生物化学研究所) 摘 要 用 ol； (dT)亲和屠析的方法从河蚌 ( 。∞把~acificaHeurJ．e)闭亮 肌 申提 取到 的 ~nRNA．能在兔网织红细胞翻译体系中有效地指导蛋 白质生物合成。对翻译产物的分析结果支 持我们关于副肌球蛋 白在河蚌闭壳肌由 勺存在方式是 】2okd和 95kd蛋白 而 102M 的 副 Il乙【球蛋 白是分离纯化过程中产生的酶解片段的看法 关键词 120kd副肌球蛋 白；102kd 副肌球蛋 白；95ka 副肌球蛋 白；m瑚 A 河蚌闭壳肌是一种具有典型的保留性收缩的肌肉组织，保留性收缩和这一类肌 肉中 含有特殊的收缩蛋 白——副肌球蛋 白有关 。我们 以前的实验证明 ：副肌球蛋 白在 河 蚌 闭壳肌 中是以120kd和 95kd的形式存在，其中95ka的舟一副肌球蛋 白是 12()ka蛋 白 的某一片段 而人们通常认为的副肌球蛋 白在体 内的存在方式——102kd的一 副肌 球蛋 白只是 120kd蛋 白的酶解片段。本文报道我们对河蚌闭壳肌mt~lA 的分离、提纯、体外 翻译和翻译产物分析的结果。这些实验结果支持我们的上述观点。 材 料 与 方 法 一 、 试赉障I材料 十九种非标记氨基酸 肌酸激酶，氯化血红 素，N 2一羟 乙基哌嗪一N 一乙碘酸乙酰 苯肼系本所东风生化试剂厂生产 。小球菌核酸酶 葡萄球菌 A蛋 白系美国Sigma公 司 产 品。磷酸肌酸系 Merck公司产 品， s-L一甲硫氨酸 (1269C~／mmo1)系 Amerslmm 公 司产品。微孔滤膜 (孔径为O．45微米)系上海医药工业研究院产品。河蚌从农贸市场购 褥 。 制备河蚌闭壳肌ml~NA 时所用的一切缓冲液和器具都经高温高压灭菌． =、免网织 红细胞体 外翻译体 系的制备 方法见文献报道 。 本文 1987年 5月 29日发到。 。系中国科学院科学基 宝资 课题． 丰文所用缩写如下：SDS-PA@E，十二癌基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝度电泳 {EDTA，乙=胺疃乙酸：。Iig。 ， 低聚脱氧胸腺墙啶：Poly(A)，多聚隙苷酸；T0A，三瓤 乙酸 ：P0P0P 1 4-双一[5一苯基嚼唑基-2】苯；PPo二苯 基艇唑 。 维普资讯 1期 河蚌闭壳肌 m1％N的体外翻译和产物分析 7 三、河蚌 闭壳肌 utRNA 的制备 1．河蚌 寸1壳肌总RNA 的制备 取新鲜或～30。0冰冻保存的河蚌闭壳肌，加入预冷 的6倍体积 的抽提 缓冲液 (O．02mol／LTris—H01 pⅡ8．9，0．5形SDS 0．04mol／I~ Na010．005mol／LMga1)，以后操作均在4~0下进行。 在组织捣碎机中匀浆5分钟， 离心 12000r／rain 10分钟。上清加 2倍体积的苯酚 ：氯仿：异戊 醇 混合 液 (5o：49：1)内 含 0．2％SDS，0．01mol／LEDTA 振荡 lo分钟，离心 10O00r／min，10分钟。有机相 加等体积抽提液振荡 l0分钟，离心 10000r／rain 10分钟，合并两次上清 。 重复酚混合 液抽提步骤至变性蛋 白层消失。水相加 2．5倍体积的无水乙醇，1／10体积浓度为 3mol／L 的NaAo(pH5．4)