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血液及骨髓标本的细菌学检验
一、标本采集
(一) 操作方法
1.将患者拟采血部位放平,扎以止血带,选好静脉穿刺点,以皮点为中心用2.5 %~3 %碘酊从内向外周擦拭,待干后再以同法用75 %乙醇脱碘。消毒范围不得过小。
2.以无菌手续由静脉取血5 ml ,立即注入适当的液体增菌培养基内, 迅速轻摇,使充分混合,以防止凝固。
(二) 注意事项
1.血液标本应在病人发热1 ~2 天内或发热高峰采集培养为宜,此时阳性率较高。
2.培养基与血液的比例为10∶1 。
3.培养一般细菌用普通肉汤或酚红葡萄糖肉汤,培养对营养要求较高的细菌用肝浸液或胰胨肉汤等。
4.采血和接种时应严格注意无菌操作,避免污染杂菌。
5.磺胺和抗生素可影响细菌检出的结果。故在采集标本时应力争在抗菌药物治疗之前。如果病人曾服用磺胺类药物,应在每100 ml 培养基内加对氨苯甲酸5 mg , 以防止磺胺类药物对细菌的抑制作用。如果病人已用青霉素治疗,应在培养基中加入青霉素酶100 U/50 ml (青霉素酶不耐热,应在临用时加入)。若病人已用其他抗生素治疗时,可用硫酸镁肉汤增菌。
6.标本的采取应以提高阳性检出率为目的。
二、检验程序
血液标本的细菌学检验程序见下图。
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三、检验方法及报告方式
(一) 一般细菌的检验
1.标本接种于肉汤培养基后,立即置35 ±1 ℃温箱内孵育,每天取出一次观察有无细菌生长,应特别注意观察肉汤内有无混浊、沉淀、菌膜、色素、血液变色、指示剂变色等现象,并记录之。如有细菌生长,肉汤可呈现各种不同的生长现象,若发生混浊,大多可疑为革兰阴性杆菌;若均匀混浊有绿色荧光,则可疑为绿脓杆菌;上面澄清,下面有沉淀,可疑为链球菌;若见自下而上的溶血现象,可疑为溶血性链球菌;若呈现肉冻样凝固现象,疑为葡萄球菌;若表面有灰白菌膜,疑为枯草杆菌或类白喉杆菌。
2.当疑有细菌生长时,应以无菌操作挑取培养物涂片进行革兰染色镜检。一旦见有细菌生长,并能排除污染,应及时转种于血平板或其他培养基进行药物敏感试验或分离培养。根据菌落特征及菌体染色镜检形态,可得出初步印象,并需继续培养,按各种属细菌加以鉴定。报告:“有X X X 菌生长”。
3.如不见细菌生长,应继续培养至第7 天,取出后接种于血平板,经培养仍无细菌生长时,可报告为:“经7 天培养无细菌生长。” 对于亚急性心内膜炎病人标本,应培养一个月,才能作出结论。
(二)布氏杆菌的检验
将可疑为布氏杆菌的血液标本接种于肝浸液2 支,分别置于10 %二氧化碳环境中及普通环境中35 ±1 ℃ 培养,每天观察一次,每隔5 天移种一次血平板。培养1 周后,若肝浸液有此菌生长时,出现肉眼可见的轻度混浊,久之可出现菌膜并有粘稠性沉淀物。此时应作涂片染色镜检,并立即移种于2 份肝浸液平板或血平板,分别置于10 %二氧化碳及普通环境下培养。如菌落及涂片染色镜检形态典型,再作布氏杆菌血清凝集试验,如为阳性,可报告为:“培养出布氏杆菌”。必要时,可将分离的菌株进一步鉴定及分型。若培养3 ~4 周后仍无细菌生长者,则可报告:“经X 周培养无细菌生长。”
(三)脑膜炎奈瑟菌培养
首先将胰胨肉汤或含2g/L 葡萄糖的肝浸液(或肉浸液) 预温至35 ℃,然后再将病人的血液标本注入培养基瓶中,摇匀后培养于10 % 二氧化碳环境中, 每天观察一次。如疑有细菌生长,再移种于经35 ℃预温的巧克力色血平板或血平板进行划线分离,然后于35 ±1 ℃、5 %~10 %二氧化碳环境中培养18 ~48 小时, 如发现平板上有光滑、湿润、透明、粘性的菌落且中等大小,经革兰染色为阴性双球菌者, 可做出初步报告:“有脑膜炎奈瑟菌生长。” 同时挑取菌落接种于预温的巧克力色或血平板同上法行纯培养。经涂片染色镜检确定后,作糖发酵、氧化酶、自凝现象,血清玻片凝集等试验,以与其他奈瑟菌区别。如各项检查均符合此菌者,必要时再用分群血清作玻片凝集进行分群作出最后鉴定。
(四) 伤寒沙门菌及其它沙门菌培养
将病人的血液接种于葡萄糖胆汁肉汤或胆盐肉汤中,经增菌培养后,如疑有细菌生长,再移种到选择性平板(如SS 琼脂平板,中国蓝平板等) 上作划线分离, 置35 ±1 ℃培养16 ~24 小时后,挑取可疑菌落接种于双糖或三糖铁高层斜面培养基, 观察其生化反应。根据生化反应,可初步区别细菌类属。再与多价诊断血清作凝集试验,即可作出初检报告。必要时,用纯培养物进一步作生化反应和选用适当的因子血清作凝集试验,加以鉴定,即可确诊。若无细菌生长,培养至第7 天即可报告:“培养7 天无细菌生长”。
(五) 厌氧菌培养
将血液标本接种于肝浸汤培养基中,然后置厌氧环境中培养。如有细菌生长,移种两个血平板或K V A 血平板(或LK V 、苯乙醇血平板) 上,分别作厌氧培养和普通培养,经35 ±1 ℃4
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