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等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变 作者：申徐良 陈方平 魏 武 张梅香 史文芝 秦小琪 徐洪亮 【摘要】 目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测 方法 。方法：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR（Allele specific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果：本AS-PCR法可对JAK2基因扩增出364 bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203 bp的突变条带。只有野生型内参照条带364 bp可被BsaX消化切割。结论：AS－PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功 应用 于临床检测。 【关键词】 等位基因特异性-PCR；JAK2V617F突变；限制性内切酶BsaX Abstract Objective:To establish a sensitive and specific test for JAK2V617F point mutation. Methods: Genomic DNA was isolated from HEL cells or Peripheral-blood cells from normal volunteer. Allele-specific polymerase chain reactions (AS-PCR) and restriction enzyme digestion were performed to detect the mutation in genomic DNA.Results:A control band(364 bp) can be obtained by AS-PCR,and a muted band(203 bp) can be obtained only when JAK2V617F was presented.Only wildtype control band(364 bp) can be digested by restriction enzyme BsaXⅠ.Conclusion:AS-PCR and restriction enzyme digestion were sensitive and specific tests for JAK2V617F point mutation, and can be successfully used for clinical test. Key words Allele specific-PCR;JAK2V617F mutation;Restriction enzyme BsaXⅠ JAK2基因属JAKs(Janus kinases/Just another kinases )家族成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶, 在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用［１］。2005年，Baxter［２］和Kralovucs［３］先后发现大部分骨髓增殖性疾病患者携带有一个获得性的JAK2基因突变-JAK2V617F，该基因突变位于JAK2 基因第1 849位，原来的鸟嘌呤（G）被胸腺嘧啶（T）所取代，导致原位于617 位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸( G→T, JAK2V617F)。该突变的阳 性率在PV 中高达65%～97%、ET 为23%～57%和IMF 为35%～57%，在AML/CML 中有少量表达［２～6］。JAK2V617F基因突变的发现是近年来骨髓增殖性疾病发病机制的突破性进展，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2 时代 ”。JAK2V617F的发现对于临床上骨髓增殖性疾病的诊断和鉴别诊断有非常重要的意义。为此，我们在临床上建立了两种敏感特异的JAK2V671F点突变的检测方法－等位基因特异性－PCR法（Allele specific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化法。这两种方法的应用，有利于提高骨髓增殖性疾病的临床诊断水平。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 HEL细胞株购自 中国 科学 院上海科学 研究 院，培养于含10%胎牛血清(Hyclone)、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素的RPMI1640(Gibco)培养基中，置于37 、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3 d换液一次。待细胞生长至80%汇合时以13的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。 1.2 基因组DNA制备 HEL细胞基因组和正常人血液基因组DNA用血液基因组提取试剂盒（上海生物工程公司产品）提取。 1.3 AS-PCR及产物 分析 PCR